文章標(biāo)題：Multi-omics profifiling visualizes dynamics of cardiac development and functions
發(fā)表期刊：Cell Reports
影響因子：9.995
作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)
百趣提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)HD-MIX版

研究背景
哺乳動(dòng)物的心臟發(fā)育是一個(gè)多階段且受到嚴(yán)格調(diào)控的復(fù)雜過程，受到多種信號(hào)分子和通路在不同時(shí)間和空間上的共同精確控制，倘若此過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)受到影響將會(huì)導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。因此，系統(tǒng)闡述心臟發(fā)育和成熟中的關(guān)鍵分子并解析相關(guān)疾病發(fā)生分子機(jī)制尤為重要。然而，目前心臟發(fā)育的組學(xué)研究大多基于基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，且未有研究通過全生命周期的多組學(xué)研究來探討心臟發(fā)育和成熟的關(guān)鍵因子，阻礙了我們系統(tǒng)地理解心臟發(fā)育全過程和心臟出生缺陷發(fā)病的病因。

研究方法
為了繪制心臟發(fā)育全周期多組學(xué)圖譜，南京醫(yī)科大學(xué)科研團(tuán)隊(duì)基于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多種組學(xué)手段，描繪了心臟發(fā)育和成熟進(jìn)程中關(guān)鍵通路和調(diào)控因子的分子圖譜和轉(zhuǎn)換模式。

研究結(jié)果
1小鼠心臟的多組學(xué)分析

圖1. 心臟發(fā)育過程中磷酸蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的時(shí)間動(dòng)態(tài)

基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的分析發(fā)現(xiàn)，超過一半的基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平之間顯示出相對(duì)較低的相關(guān)性（圖1A和1B）。但隨著時(shí)間的推移，相關(guān)性逐漸增加最終趨于穩(wěn)定，結(jié)果表明絕對(duì)mRNA水平可能不能預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)豐度。

使用K-means聚類分析將小鼠心臟發(fā)育的10個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)時(shí)期：E10.5–14.5的I期、E16.5–2W的II-III期和4W–8W的IV期（圖1E）。I期基因表達(dá)和磷酸化的相關(guān)性顯著更高（圖1F），這驗(yàn)證了磷酸化在早期心臟發(fā)育中參與信號(hào)強(qiáng)烈。

2心臟發(fā)育和成熟的多組推斷和富集途徑

圖2. 心臟發(fā)育和成熟過程中三組學(xué)的關(guān)鍵途徑
 

3 MAPK和AKT通路平衡在調(diào)節(jié)心臟發(fā)育表型轉(zhuǎn)換中的作用

圖3. 心臟發(fā)育過程中信號(hào)動(dòng)力學(xué)的表征和關(guān)鍵激酶底物的預(yù)測(cè)
 

蛋白磷酸化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和級(jí)聯(lián)中翻譯后修飾的關(guān)鍵。研究人員假設(shè)具有相似時(shí)間動(dòng)力學(xué)的磷酸化位點(diǎn)更可能是相同激酶的底物，將所有磷酸化位點(diǎn)分為三個(gè)主要磷酸肽簇（圖3A、4B）。分別闡述不同簇的特征：簇1的特征是早期顯著激活，隨后磷酸化水平降低，包括MAPK、CDK和CLK3種蛋白激酶（圖3B），并在下游途徑中顯著富集，如蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞間粘附和蛋白質(zhì)降解（圖3C）。簇2在II-III階段顯示延遲激活和衰減（圖3B）。除了進(jìn)一步激活細(xì)胞-細(xì)胞粘附和切換到激素信號(hào)通路之外，簇2中顯著富集通路與簇1中的通路相似（圖3C）。簇3顯示磷酸化水平的穩(wěn)定增加，表明在心臟發(fā)育后期激活（圖3B），該簇磷酸化位點(diǎn)的磷酸蛋白主要富集于心臟的生理和病理過程，包括心肌收縮（圖3C）。

另外，研究團(tuán)隊(duì)采用了iGPS算法（帶相互作用過濾器的GPS算法，或體內(nèi)GPS），確定了MAPK、CDK和CLK在早期胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，它們顯著富集了簇1磷酸肽，強(qiáng)調(diào)了其在啟動(dòng)磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。同時(shí)還觀察到激酶和底物磷酸化之間的時(shí)間一致性（圖3D），這說明了激酶的時(shí)間特異性功能。從E10.5到E18.5小鼠心臟，p38 MAPK的總蛋白水平保持不變，而磷酸化（p-）p38 MAPK（180T）的蛋白水平顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)了MAPK的磷酸化在心臟發(fā)育的早期階段是重要的（圖3E）。然而，磷酸化AKT1（S124）和磷酸化AKT2（S129）的蛋白水平對(duì)E14.5中的MAPK產(chǎn)生互斥激活，暗示其對(duì)心臟發(fā)育的潛在相反影響（圖3D和3E）。

這些結(jié)果反映了MAPK和AKT對(duì)心臟發(fā)育的平衡作用，其中MAPK的磷酸化主要影響心肌細(xì)胞的分化，而AKT的磷酸化則主要影響心肌的增殖。

4 識(shí)別參與早期心臟發(fā)育的核心TFs

圖4. 鑒定調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的主轉(zhuǎn)錄因子的表觀基因組方法

為了進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors, TFs)對(duì)哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育的重要性，使用表觀組學(xué)ATAC-seq技術(shù)對(duì)E10.5產(chǎn)前小鼠心臟樣本進(jìn)行了染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序分析。通過預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，從而構(gòu)建TF-TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用足跡分析來說明該階段的調(diào)控詞典（圖4A）。代謝組學(xué)分享，將所有TFs分為三組：排名前200名的I級(jí)，排名201–400名的II級(jí)，其余的III級(jí)（圖4B）。在確定的前10個(gè)TFs中，多個(gè)TFs對(duì)小鼠或胚胎干細(xì)胞模型中的心臟發(fā)育至關(guān)重要。

此外，由于更高的時(shí)間特異性和對(duì)功能性突變的不耐受性也表明了潛在的重要作用，我們?cè)u(píng)估了I期（E10.5–E14.5）的mRNA表達(dá)，以及檢測(cè)到的所有TFs的基因?qū)�功能喪失（LoF）突變不耐受的概率（pLI評(píng)分），結(jié)果與上述結(jié)論一致（圖4C）。在心臟發(fā)育早期高表達(dá)且對(duì)LoF突變不耐受的TFs中觀察到I級(jí)TFs的富集（圖4D）。代謝組學(xué)分享，此外，TFRE18的實(shí)驗(yàn)證明了這些TFs的表達(dá)和活性，I級(jí)組中檢測(cè)到的TFs的比例顯著高于II級(jí)和III級(jí)（圖4E和4F），表明I級(jí)TFs在早期心臟發(fā)育中的重要作用。

此外，作為最常見的先天性心臟病——法洛四聯(lián)癥(TOF)的患者中I級(jí)TFs的LoF和有害錯(cuò)義突變顯著高于正常對(duì)照組（圖4G），而II級(jí)和III級(jí)TFs則沒有。通過足跡分析發(fā)現(xiàn)確定的關(guān)鍵TFs對(duì)心臟發(fā)育非常重要，可能是潛在的新型TOF致病基因候選。這些分析揭示了早期心臟發(fā)生時(shí)基因表達(dá)程序的嚴(yán)格時(shí)間調(diào)控，核心TFs對(duì)心臟的正常發(fā)育至關(guān)重要。

同時(shí)，為了闡明介導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子，團(tuán)隊(duì)研究了MAPK底物的共調(diào)節(jié)因子之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)。代謝組學(xué)分享，結(jié)果表明，基于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的STRING數(shù)據(jù)，富含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑和I級(jí)TF的PPI被認(rèn)為在早期心臟發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

5 成熟小鼠心臟TCA循環(huán)和脂質(zhì)代謝途徑

圖5. 心臟發(fā)育過程中TCA循環(huán)和脂質(zhì)的代謝途徑

基于KEGG富集分析的時(shí)間代謝組譜清楚地顯示，在心臟發(fā)育過程中，代謝產(chǎn)物的數(shù)量發(fā)生了顯著變化，主要在TCA循環(huán)和心臟的脂質(zhì)代謝途徑中富集（圖5A和5B）。圖5C質(zhì)譜中可以看出脂肪酸b氧化(FAO)和TCA循環(huán)中的代謝底物被消耗，而關(guān)鍵限速酶被高度表達(dá)。代謝組學(xué)分享，此外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜顯示，成熟CM是參與TCA和FAO代謝的主要細(xì)胞亞群，表明這兩種代謝途徑是心肌收縮的主要能量來源（圖5D和5E）。

6 MHC-II+原住型巨噬細(xì)胞中花生四烯酸代謝促進(jìn)傳出細(xì)胞增生引起的凋亡細(xì)胞吞噬

圖6. 成年小鼠心臟MHC-II+原住型巨噬細(xì)胞中花生四烯酸的特異性代謝
 

花生四烯酸(AA)在心臟中也表現(xiàn)出代謝水平的上升（圖5A、5B和6B）。AA合成基因在早期的表達(dá)很高，而AA合成基因在成年小鼠心臟中高度表達(dá)則表明在后期階段AA基因具有很高的生物活性（圖6A–6C）。

單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果表明前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1（Ptgs1）是將AA轉(zhuǎn)化為前列腺素E2（PGE2）的限速步驟，在成年小鼠心臟的巨噬細(xì)胞中特異性表達(dá)（圖6D）。代謝組學(xué)分享，根據(jù)CCR2的表達(dá)和依賴性將巨噬細(xì)胞分為三個(gè)不同的簇，Ptgs1主要在某些MHC-II+原住型巨噬細(xì)胞中表達(dá)（圖6E和6F）。橫主動(dòng)脈收縮(TAC)術(shù)后MHC-II+原住型巨噬細(xì)胞的Ptgs1+細(xì)胞比例顯著增加（圖6G）。這表明Ptgs1通過促進(jìn)MHC-II+原住型巨噬細(xì)胞的成熟而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。有趣的是，在進(jìn)一步對(duì)Ptgs1高表達(dá)細(xì)胞中的上調(diào)基因進(jìn)行通路分析中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵傳出細(xì)胞受體/酶、CX3C趨化因子受體1（Cx3cr1）和生長(zhǎng)抑制特異性6（Gas6）的表達(dá)顯著高于MHC-II+/Ptgs1–原住型巨噬細(xì)胞（圖6I）。代謝組學(xué)分享，上述數(shù)據(jù)表明，AA及其代謝產(chǎn)物可能通過凋亡細(xì)胞的傳出細(xì)胞增生在組織修復(fù)中發(fā)揮潛在作用。

研究結(jié)論
該團(tuán)隊(duì)結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建磷酸激酶與底物的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)MAPKs和AKTs激酶的平衡激活是心肌細(xì)胞分化和增殖能力梯度轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵開關(guān)；還利用表觀組學(xué)ATAC-seq和功能組學(xué)TFRE技術(shù)系統(tǒng)鑒定了心臟發(fā)育早期的核心轉(zhuǎn)錄因子，類器官及遺傳分析均發(fā)現(xiàn)上述核心轉(zhuǎn)錄因子及其遺傳突變?cè)谙忍煨孕呐K病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用；最后，作者結(jié)合代謝組學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝參與心臟MHC-II+原住型巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡心肌細(xì)胞的胞葬作用。

該研究為心臟發(fā)育和成熟提供了全面的分子描述，顯著豐富了現(xiàn)有的數(shù)據(jù)集，它們一起揭示了支撐心臟發(fā)育和成熟的復(fù)雜但協(xié)調(diào)的分子機(jī)制。代謝組學(xué)分享，該方法提供了一個(gè)通用框架的示例，該框架能夠?qū)Σ煌�器官或組織發(fā)育的多層次控制進(jìn)行新的理解，并為驗(yàn)證致病性突變、告知疾病機(jī)制提供功能注釋。