人體分布著多種器官，那你知道人體最大的器官是什么嗎？
我知道，是「皮膚」。

皮膚覆蓋于我們身體的表面，他是直接保護我們身體的最外層屏障，承擔著保護身體、排汗、感受外界環(huán)境冷熱和壓力等使命，并具有自我更新、自我修復的功能。同時，健康美麗的皮膚也是顏值美學的加分項，《詩經(jīng)》中就稱贊女子“膚如凝脂”。

接下來，一起來了解皮膚中的細胞吧。
 

皮膚與成纖維細胞
 

皮膚的結構從外到內(nèi)分別為表皮、真皮、皮下組織。其中真皮層含有豐富的膠原蛋白、纖維結締組織，還有纖維細胞和組織細胞存在于其中。
 

圖. 皮膚結構
Experimental Dermatology
https://doi.org/10.1111/exd.12832

人成纖維細胞是皮膚真皮層中最主要的細胞，也就是本文要介紹的主角。

成纖維細胞雖不是間充質(zhì)干細胞，但是他卻擁有近似間充質(zhì)干細胞的特性，如擁有相同的細胞表面標記物，能夠表達CD105、CD73、CD90，不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR；能夠在體外被誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞等。

同時也有另一種觀點認為，這種成纖維細胞異質(zhì)性強，但并不是所有的成纖維細胞都具有間充質(zhì)干細胞的特性，因此并不能將他歸類為間充質(zhì)干細胞。盡管他的身份在科學界頗有爭議，但不妨礙他展露令人驚艷的超能力，并成為皮膚衰老機制研究、皮膚損傷修復應用等熱門研究的必備工具細胞。
 

如何獲取人成纖維細胞？

了解了皮膚和成纖維細胞的故事，那該如何分離獲取人成纖維細胞呢，這就帶你去研究。

材料準備

• 樣本：包含真皮層的皮膚組織，面積≥5mm²，采集時間＜12小時。樣本保存液：基礎培養(yǎng)基+1%雙抗10mL，保存溫度4℃。

• 試劑：OriCell^®PBS 100mL、OriCell^®人成纖維細胞完全培養(yǎng)基50mL、OriCell^®Collagenase Type I (0.1%)一型膠原蛋白酶。

• 耗材：50mL無菌采集瓶一個、50mL離心管5-10個、10mL移液管4個、T25及T75培養(yǎng)瓶若干個。

• 器械：止血鉗、眼科鑷、眼科剪。

分離提取

1.1 從采集瓶中取出皮膚組織，放入裝有20mL含雙抗和PBS的50mL離心管中，反復清洗3min以充分洗滌皮膚組織，直到清除皮膚組織殘留的雜質(zhì)及血液。

1.2 轉移至裝有20mL 75%酒精離心管中消毒40秒，再用PBS沖洗兩次。

注意：由于皮膚組織直接與外界接觸，非無菌組織，所以盡量在消化前最大化對組織進行沖洗和消毒。

1.3 一型膠原蛋白酶消化：加入等體積新配制的預熱（提前半小時于37℃的CO₂培養(yǎng)箱預熱）的一型膠原蛋白酶溶液，封口膜封口，劇烈晃動培養(yǎng)瓶5~10秒，置于4℃冰箱，消化過夜。

1.4 第二天取出，剝掉表皮及脂肪組織，充分剪碎。

注意：由于皮膚成纖維細胞存在于真皮層，所以盡量去除真皮層以外的所有組織，以免混入雜細胞。

1.5 一型膠原蛋白酶消化：加入等體積新配制的預熱（提前半小時于37℃的CO₂培養(yǎng)箱預熱）的一型膠原蛋白酶溶液，封口膜封口，劇烈晃動培養(yǎng)瓶5~10秒，置于氣浴搖床中，37℃，150rpm，消化90min。

1.6 加入2mL完全培養(yǎng)基，終止消化，PBS定容至90mL，分裝至2支50mL離心管中，250×g，6min離心。

1.7 棄上清，培養(yǎng)基重懸后合并至一管，PBS定容至45mL，250×g，6min離心。

1.8 10mL PBS重懸細胞，吹散，將消化后的組織用100μm細胞濾網(wǎng)過濾后分裝到兩個50mL的離心管中，PBS定容至30mL，從濾網(wǎng)夾取少量組織均勻鋪平放入待接種細胞的T25培養(yǎng)瓶底。

1.9 室溫250×g，6min離心。

1.10 吸去上清液，不能直接倒掉。

1.11 加入10mL PBS重懸細胞，250×g，6min離心。

1.12 離心后去上清，加3mL完全培養(yǎng)基重懸細胞。

1.13 將細胞懸液接種到1個T25培養(yǎng)瓶中。

1.14 將培養(yǎng)瓶水平放入37ºC, 5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.15 24h后觀察細胞，看細胞是否有貼壁或污染現(xiàn)象。

換液操作

2.1 原代接種第3天進行第一次半量換液。

2.2 輕輕將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒入50mL離心管中，250×g，6min離心。

2.3 向T25培養(yǎng)瓶中加入離心完畢的1.5mL舊培養(yǎng)基，加入1.5mL新完全培養(yǎng)基，半量換液完畢。

2.4 將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。

2.5 完成第一次換液后每隔3天進行一次半量換液(可以根據(jù)生長情況適當調(diào)整)，半換液直到細胞生長至90%匯合即需傳代。

傳代培養(yǎng)

（P0傳P1與P1后傳代的操作方法流程一致）

3.1 將完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶預熱至37℃。

3.2 吸去培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基。用PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T25培養(yǎng)瓶加入約3mL)洗滌細胞2次注意動作輕柔，清洗全面。吸去PBS。

3.3 加入胰酶(T25培養(yǎng)瓶加入約1.5 mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3mL)，迅速鋪勻，保證充分接觸細胞表面。

3.4 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入完全培養(yǎng)基(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)，隨即輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。

3.5 使用吸管或移液管吸取細胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細胞都吹打下來。

注意: 吹打動作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細胞。

3.6 將細胞懸液轉移至離心管中。用PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約 6mL)洗滌容器1次，收集殘留細胞。

3.7 收集的所有細胞懸液以250×g，離心4min。

3.8 離心后去除上清。加入2mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻。

3.9 將細胞按(2.5~4)×10⁴個活細胞/cm²接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

注意：培養(yǎng)皮膚成纖維細胞對于細胞密度有較高的要求，我們建議有條件且計數(shù)效率較高的情況下，進行手工計數(shù)，以期獲得精準的細胞濃度指導接種;在沒有精確計數(shù)條件的情況下，按照適宜比例傳代是更好的方法。通常皮膚成纖維細胞傳代比例為1:3，72h內(nèi)生長至可傳代匯合度。請根據(jù)細胞實際生長情況調(diào)整傳代比例。

3.10 搖勻細胞，放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。

3.11 傳代次日，觀察細胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細胞，應予以換液。待細胞生長至 90%匯合，即需傳代或凍存。

注意：正常情況下皮膚成纖維細胞每代生長時間不超過72h，中途不需要換液，頻繁換液會破壞構建起的細胞微環(huán)境。