期刊：Science Advances（IF 14.98）
測(cè)序技術(shù)：空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

導(dǎo)語
原發(fā)性肝癌（PLC）是死亡率第二高的腫瘤，其中肝細(xì)胞癌（HCC）和肝內(nèi)膽管癌（ICC）是兩種主要的組織學(xué)亞型。病因包括慢性肝炎病毒感染、過度應(yīng)激、藥物性肝損傷、黃曲霉毒素 B 暴露、未解決的炎癥和復(fù)雜性TME，都可能導(dǎo)致 PLC 的高度腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。到目前為止，PLC幾乎沒有有效的非手術(shù)策略，并且缺乏有效的治療干預(yù)的特定藥物靶點(diǎn)。只有有限比例的HCC患者可以從現(xiàn)有的酪氨酸激酶抑制劑藥物（如索拉非尼）和免疫檢查點(diǎn)抑制劑中受益，這主要是由于腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。

科學(xué)問題
不同的 PLC 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)提供了新的見解，并對(duì)癌癥干預(yù)具有潛在的益處。

科學(xué)技術(shù)
利用10x Genomics Visium平臺(tái)對(duì)這些切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

研究?jī)?nèi)容
異質(zhì)性是癌癥預(yù)防和治療的主要挑戰(zhàn)。該研究首先構(gòu)建了原發(fā)性肝癌(PLC)的高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，包含來自7名患者21個(gè)組織中的84,823個(gè)spot。將空間腫瘤微環(huán)境(TME)特征從非腫瘤區(qū)、邊緣區(qū)到腫瘤區(qū)進(jìn)行漸進(jìn)式比較，發(fā)現(xiàn)腫瘤包膜可能影響腫瘤內(nèi)空間簇連續(xù)性、轉(zhuǎn)錄組多樣性和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。在局部，該研究發(fā)現(xiàn)在100mm寬的簇-簇邊界上的雙向配體-受體相互作用有助于維持腫瘤內(nèi)結(jié)構(gòu)，而PROM1+和CD47+腫瘤干細(xì)胞龕位與TME重塑和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。最后，該研究提出了一種TLS-50標(biāo)記，用于在空間上精確定位三級(jí)淋巴樣結(jié)構(gòu)(TLS)，并揭示了TLS的獨(dú)特組成是由它們與腫瘤細(xì)胞的距離決定的。

研究路線圖

研究結(jié)果
1. 利用空間轉(zhuǎn)錄組對(duì)原發(fā)性肝癌的結(jié)構(gòu)探索
對(duì)于本研究中的Visium空間基因表達(dá)解決方案，根據(jù) H&E 圖像顯示，每個(gè)Spot直徑達(dá)到 55 μm，捕獲大約 8-20 個(gè)細(xì)胞。測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，每個(gè)點(diǎn)的基因中位數(shù)約為3000個(gè)。一般來說，腫瘤區(qū)域的 UMI 數(shù)量大于正常區(qū)域的數(shù)量，這與之前的研究一致。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征是否與組織學(xué)信息一致，我們將 H&E 染色圖像與其對(duì)應(yīng)的 ST 數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。結(jié)果證實(shí)，由細(xì)胞類型標(biāo)記基因表達(dá)定義的區(qū)域與病理圖像高度一致。具體而言，ALB和CYP2E1在正常區(qū)域高表達(dá)；腫瘤區(qū)域中的 GPC3 和 ARK1B10高表達(dá)；KRT19 在膽管癌區(qū)域高表達(dá)；COL1A1 在被膜和間質(zhì)區(qū)域高表達(dá)。
 

2. 原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性的不同表型
為了表征原發(fā)性肝癌的空間多樣性，該研究將來自每個(gè)患者不同部位的spot進(jìn)行了聚類分析，并用UMAP展示。該研究發(fā)現(xiàn)HCC-1T、HCC-3T和HCC-4T中的聚類具有區(qū)域分布特征，而HCC-2T和cHC – 1T中的聚類是相互交織的。HCC-3L中的Cluster 5是一個(gè)獨(dú)特的Cluster，在HCC-3N和HCC-3T中都沒有出現(xiàn)。
 

該研究還使用基于基因的策略來比較不同亞群中不同細(xì)胞類型的得分。值得注意的是，間質(zhì)區(qū)域的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞評(píng)分明顯較高，不同腫瘤簇區(qū)域的免疫細(xì)胞評(píng)分表現(xiàn)出高度的多樣性。通過擬合細(xì)胞類型得分的變化曲線（包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞），該研究發(fā)現(xiàn)與基質(zhì)區(qū)域相關(guān)的簇狀細(xì)胞形成了成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞甚至免疫細(xì)胞的變異表型：T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的變異模式是高度相似的，而NK細(xì)胞和髓細(xì)胞是高度變異的。
 

3. 腫瘤邊緣微環(huán)境特征
HCC-1、HCC-3和HCC-4中的腫瘤邊緣&腫瘤組織切片的腫瘤區(qū)域具有更高的空間連續(xù)性和更低的轉(zhuǎn)錄組多樣性。包膜完整的腫瘤組織具有較高的空間連續(xù)性和較低的轉(zhuǎn)錄組多樣性，其完整性與腫瘤細(xì)胞的空間異質(zhì)性及其周圍間質(zhì)和免疫細(xì)胞的分布密切相關(guān)�；�因組變異分析發(fā)現(xiàn)，包膜完整性對(duì)正常和腫瘤區(qū)域的信號(hào)通路活性影響不大。
 

4. 原發(fā)性肝癌腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性
通過每個(gè)腫瘤Cluster的標(biāo)志通路活性的分層聚類分析，確定出兩個(gè)模塊，Module-1 顯示細(xì)胞周期和代謝相關(guān)通路的高活性；而 Module-2 在炎癥、血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化方面具有更高的活性。HCC-1的腫瘤Cluster屬于兩個(gè)不同的模塊，T.2（在HCC-1T中代表Cluster2）為模塊2，T.5&6（在HCC-1T中代表Cluster5&Cluster6）為模塊1。從空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推斷出的拷貝數(shù)變異大多與WES數(shù)據(jù)一致，這表明從空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推斷出的拷貝數(shù)變異是可靠的。而且空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在不同腫瘤簇之間產(chǎn)生了更微妙的拷貝數(shù)異質(zhì)性。這些結(jié)果表明腫瘤內(nèi)存在廣泛的空間異質(zhì)性，某些腫瘤的不同亞群具有不同的通路活性和不同的細(xì)胞起源，不同亞群的細(xì)胞通訊可能對(duì)腫瘤的生態(tài)和進(jìn)化至關(guān)重要。
 

5. 原發(fā)性肝癌異質(zhì)性腫瘤干細(xì)胞（CSC）的功能分析
CSCs被認(rèn)為是肝癌腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的重要因素。不同的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物所定義的不同細(xì)胞亞群可能包含不同的致癌驅(qū)動(dòng)因子。在這里，該研究集中探討了五種常用的肝癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物(CD47、EPCAM、KRT19、PROM1和SOX9)。對(duì)于每個(gè)標(biāo)記物（marker），將每個(gè)患者腫瘤spot中表達(dá)量最高的前5%的spot定義為標(biāo)記物陽性的CSC生態(tài)位。通過比較L/T/P部分CSC生態(tài)位的比例，該研究發(fā)現(xiàn)在HCC-2中，CD47-、SOX9-和PROM1陽性的比例逐漸增加，而EPCAM或KRT19基因并沒有表現(xiàn)出這樣的現(xiàn)象。
 

6. 三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的空間分布及臨床特征
TLS是一種異位的淋巴結(jié)構(gòu)，為DC的成熟、抗原呈遞以及T和B細(xì)胞的激活和分化提供了一個(gè)區(qū)域，這與抗腫瘤免疫反應(yīng)和潛在的免疫治療反應(yīng)有關(guān)。在這里，該研究注意到HCC-5的cluster 6具有高表達(dá)CXCL13、CCL19、CCL21、LTF、LTB、CD79A/B等的特征，這些都是TLS形成的必要分子。通過與H&E染色相結(jié)合分析，cluster6被鑒定為TLS區(qū)域。該研究選擇了cluster6中高特異性表達(dá)的前50個(gè)基因（TLS-50）作為特征基因，并測(cè)試了其識(shí)別TLS的能力。病理學(xué)家證實(shí)，與其他信號(hào)(包括乳腺癌、12-趨化因子、T輔助性1和B細(xì)胞、T濾泡輔助性細(xì)胞、CXCL13和漿細(xì)胞信號(hào))相比，TLS-50可以識(shí)別信號(hào)噪聲比更高的TLS區(qū)域。通過使用TLS-50定位不同切片的TLS點(diǎn)，該研究發(fā)現(xiàn)它們主要存在于L切片而不是T和N切片，尤其是在L切片的非腫瘤區(qū)域。
 

參考文獻(xiàn)：
Wu R, Guo W, Qiu X, Wang S, Sui C, Lian Q, Wu J, Shan Y, Yang Z, Yang S, Wu T, Wang K, Zhu Y, Wang S, Liu C, Zhang Y, Zheng B, Li Z, Zhang Y, Shen S, Zhao Y, Wang W, Bao J, Hu J, Wu X, Jiang X, Wang H, Gu J, Chen L. Comprehensive analysis of spatial architecture in primary liver cancer. Sci Adv. 2021 Dec 17;7(51):eabg3750. doi: 10.1126/sciadv.abg3750. Epub 2021 Dec 17. PMID: 34919432; PMCID: PMC8683021.