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研究背景

微囊藻毒素（MCs）經(jīng)常在全球富營養(yǎng)到超營養(yǎng)的湖泊、池塘和河流中發(fā)現(xiàn)。近年來，嚴(yán)重藍(lán)藻藻華出現(xiàn)的頻率和強(qiáng)度有所增加。微囊藻毒素-lr（MC-LR）是MCs的一種主要毒性形式，因其很強(qiáng)的毒性和廣泛的分布而廣受關(guān)注。在藍(lán)藻水華期間，MC-LR的濃度往往超過了世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定量。人的身體接觸MC-LR污染的食物會(huì)伴隨微粒吸入，從而影響健康。因此，高濃度的MC-LR對(duì)公共衛(wèi)生的影響不容忽視。

 

2023年1月，東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉冉課題組在（IF：9.988）上發(fā)表了題為的研究成果，該研究通過TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析MC-LR處理的和未受處理的SGC-7901細(xì)胞的蛋白和磷酸化的差異，并通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)雌激素信號(hào)通路可能是其影響細(xì)胞的關(guān)鍵通路。

 

 

中文標(biāo)題：綜合蛋白質(zhì)組學(xué)和磷蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，微囊藻毒素- lr通過雌激素潛能參與胃癌的惡性進(jìn)展

研究對(duì)象：SGC-7901細(xì)胞

發(fā)表期刊：Environmental Pollution

影響因子：9.988

發(fā)表時(shí)間：2023年1月15日

運(yùn)用組學(xué)技術(shù)：TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白組學(xué)（皆由鹿明生物提供技術(shù)支持）

 

研究背景

有研究表明，長期暴露于MC-LR可能導(dǎo)致前列腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌，它被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)視為潛在的人類致癌物。然而，胃作為重要的消化器官，MC-LR對(duì)胃癌（GC）進(jìn)展的影響尚不清楚。該研究旨在使用組學(xué)的方式確定MC-LR對(duì)胃癌進(jìn)展的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

 

研究思路

 

研究結(jié)果

 

1. MC-LR可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡

為了確定MC-LR在體外觸發(fā)胃癌細(xì)胞作用的最佳濃度，使用6種濃度MC-LR處理SGC-7901細(xì)胞（胃腺癌細(xì)胞）24 h。通過細(xì)胞活力、凋亡細(xì)胞數(shù)量、遷移水平和侵襲水平分析，最終確認(rèn)100 nM的MC-LR適合用于胃癌的進(jìn)一步研究（圖1）。

 

圖1 | MC-LR對(duì)胃癌惡性進(jìn)展的影響

 

2. SGC-7901細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析

為了進(jìn)一步分析MC-LR誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的反應(yīng)，并探索相關(guān)的通路，研究者進(jìn)行了TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了蛋白質(zhì)的豐度和磷酸化狀態(tài)的變化。主成分分析（PCA）顯示MC-LR處理組和未處理組之間有明顯的分離（圖2B和C）。TMT蛋白組學(xué)鑒定出來自6320個(gè)蛋白的48109條特異性肽段。修飾化蛋白組學(xué)鑒定出來自1375磷酸化蛋白的3218個(gè)特異的磷酸肽（圖2D）。蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)共同鑒定出1231個(gè)蛋白（圖2E）。

 

圖2 | mc-lr誘導(dǎo)的SGC-7901蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組

 

3.在SGC-7901細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)分析揭示了MC-LR誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)組圖譜

MC-LR處理的細(xì)胞和對(duì)照組相比，共鑒定出22個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEPs），其中有7個(gè)上調(diào)蛋白（YIF1A、KDELR1、HIKESHI、CCNE1、CCDC9、KRT16和C12orf29）及15個(gè)下調(diào)蛋白（BUD13、HRNR、RCOR3、SYNRG、KRT1、GOLGA5、DCD、KRT10、KRT9、SLC26A6、KIAA0319L、MRPS24、ZNF207、TNFRSF12A和DNAJB14）（圖3B）。為了研究由MC-LR引起的病理相關(guān)的生物學(xué)過程，對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析。DEPs主要參與甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)、甘露醇轉(zhuǎn)運(yùn)、RES復(fù)合物、細(xì)胞包膜和無機(jī)陰離子交換活性（圖3C）。在KEGG通路分析結(jié)果中，DEPs參與了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、礦物質(zhì)吸收、雌激素信號(hào)通路和胃癌等通路（圖3D）。

 

圖3 | 差異蛋白分析

 

4.蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，雌激素信號(hào)通路可能在MC-LR處理細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用

其它研究表明，蛋白磷酸酶PP1和PP2A是MC-LR促進(jìn)癌癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步探索MC-LR處理的蛋白磷酸化和去磷酸化控制的信號(hào)通路，進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，磷酸化蛋白質(zhì)分離成兩個(gè)簇，共178條差異磷酸化肽段對(duì)應(yīng)87個(gè)蛋白（圖4A和B）。分析所有修飾位點(diǎn)的分布情況發(fā)現(xiàn)，有60.11%的蛋白質(zhì)分有多個(gè)修飾位點(diǎn)（位點(diǎn)≥2，圖4D）。

 

GO分析結(jié)果顯示，DEPPs主要參與RNA剪接、mRNA加工、核漿、核斑點(diǎn)、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性和Poly (A) RNA結(jié)合等條目（圖4E）。KEGG通路分析結(jié)果顯示，DEPPs主要富集于抗原加工和呈遞、雌激素信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和MAPK信號(hào)通路（圖4F）。有趣的是，蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組中KEGG富集前20條通路中共富集到雌激素信號(hào)通路，該通路可能在MC-LR觸發(fā)的胃癌進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖4G）。

 

圖4 | 蛋白質(zhì)磷酸化表達(dá)分析揭示了MC-LR觸發(fā)的磷酸化蛋白質(zhì)組譜

 

5.MC-LR損害Hsp90的磷酸化，導(dǎo)致激活的ERα從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核

 

使用Motif-X來分析這些磷酸化位點(diǎn)位置的特異性頻率，蛋白質(zhì)激酶傾向于使一個(gè)特定的基序磷酸化。因此，通過磷酸化位點(diǎn)獲得的三個(gè)氨基酸序列可以為磷酸化蛋白的分類和預(yù)測(cè)其信號(hào)通路提供有用的信息（圖5 A）。根據(jù)蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組結(jié)果，在雌激素信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)，在MC-LR處理的SGC-7901細(xì)胞中，Krt16蛋白表達(dá)升高，Hsp90磷酸化水平降低（圖5 B）。為了研究MC-LR是否參與了ERα從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的過程，作者分析了細(xì)胞質(zhì)和核提取物中ERα的水平。結(jié)果顯示，經(jīng)MC-LR處理后，ERα核易位增加（圖5 C和D）。

 

同時(shí)，采用qPCR和WB技術(shù)評(píng)估ERα核易位對(duì)下游靶點(diǎn)Krt16水平的影響。有趣的是，結(jié)果顯示Krt16的表達(dá)顯著增加（圖5 E-G）。使用Kaplan-Meier繪圖儀在881例胃癌患者中鑒定了與總生存率相關(guān)的Krt16基因。如圖5 H所示，角蛋白16的高表達(dá)與胃癌總生存率較差相關(guān)。綜上所述，MC-LR通過降低Hsp90的磷酸化而過度激活雌激素信號(hào)通路，從而導(dǎo)致胃細(xì)胞中活化的ERα的核易位和Krt16的過表達(dá)（圖5 I）。

 

 

圖5 | MC-LR通過損害Hsp90磷酸化介導(dǎo)的ERα核轉(zhuǎn)運(yùn)來促進(jìn)Krt16的表達(dá)

 

研究結(jié)論

飲用水中廣泛存在的藍(lán)藻毒素對(duì)公共健康構(gòu)成了威脅。MC-LR是MCs的一種主要毒性形式，已被發(fā)現(xiàn)在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作者運(yùn)用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了MC-LR可能有影響雌激素信號(hào)通路的潛能。它通過降低Hsp90的磷酸化，過度激活雌激素信號(hào)通路，從而導(dǎo)致胃細(xì)胞中激活的ERα的核易位和Krt16的過表達(dá)。這些結(jié)果可能為雌激素促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展提供了證據(jù)。

本文通過TMT蛋白組學(xué)和磷酸化蛋白組學(xué)檢測(cè)了100 nM的MC-LR處理的和未受處理的SGC-7901細(xì)胞，確定了暴露于MC-LR的SGC-7901細(xì)胞的差異表達(dá)模式和異常通路。蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析表明，雌激素信號(hào)通路可能在MC-LR影響細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。
 

鹿明生物在質(zhì)譜領(lǐng)域經(jīng)過多年發(fā)展，建立起了單細(xì)胞/微量蛋白質(zhì)組學(xué)、4D-DIA/LFQ/PRM、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修飾蛋白組等蛋白組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，TMT標(biāo)記定量蛋白組和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)更是熱推技術(shù)，更多組學(xué)咨詢歡迎長按二維碼咨詢鹿明生物技術(shù)工程師~