例如乳腺癌細(xì)胞系JIMT-1增殖速度就遠(yuǎn)快于BT-474，因此建議大家先拿細(xì)胞株做個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，以便正式實(shí)驗(yàn)時(shí)合理安排實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。

Tips：對(duì)于生長(zhǎng)速度較慢的腫瘤細(xì)胞可選用基質(zhì)膠，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，通常加入30-50%的基質(zhì)膠。

 
不同乳腺癌細(xì)胞成瘤曲線

其次，細(xì)胞接種量和細(xì)胞狀態(tài)也是關(guān)鍵。接種細(xì)胞數(shù)量過(guò)少可能在老鼠皮下不能成瘤或成瘤后生長(zhǎng)極慢，但接種量過(guò)多則可能引起腫瘤瘋長(zhǎng)，出現(xiàn)這些情況并不利于實(shí)驗(yàn)順利開(kāi)展。細(xì)胞接種量一般通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定或者做預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)通常在5E5-1E7細(xì)胞量之間設(shè)置梯度實(shí)驗(yàn)，接種體積為100-200 uL（細(xì)胞過(guò)量可能導(dǎo)致泄漏）。
 

裸鼠皮下注射HepG2細(xì)胞4周后腫瘤形成圖

接種細(xì)胞要選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)病毒、細(xì)菌或支原體等污染，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。細(xì)胞短途運(yùn)輸時(shí)可采用濕冰運(yùn)輸，如用冰袋，冰袋不可直接接觸細(xì)胞，若短時(shí)間內(nèi)運(yùn)輸室溫即可。

02 動(dòng)物
選擇了合適的細(xì)胞株后，就要考慮用什么品系的小鼠來(lái)接種。對(duì)于來(lái)自小鼠的腫瘤細(xì)胞系，需要保持小鼠背景一致，如果腫瘤細(xì)胞系接種到背景品系不同的小鼠上，由于免疫系統(tǒng)的攻擊，腫瘤細(xì)胞很難成瘤。如MC38是來(lái)自B6小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞系，所以適于其接種的小鼠背景的是B6。

而藥效實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞株多為人源細(xì)胞株，人源細(xì)胞株更為接近人類(lèi)腫瘤增殖情況，但卻需要選擇免疫缺陷小鼠，如M-NSG小鼠。Raji細(xì)胞系是人Burkitt's 淋巴瘤細(xì)胞系，皮下接種后，腫瘤生長(zhǎng)較慢，20天后腫瘤體積達(dá)到1000mm³。
 

確定品系后，就要選擇合適鼠齡的小鼠，通常為6-8周齡的小鼠，老年鼠皮下脂肪及結(jié)締組織疏松，容易接出不規(guī)則的腫瘤。同一批小鼠周齡和體重差異要盡量小。小鼠進(jìn)入動(dòng)物房后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周左右，待其適應(yīng)新環(huán)境后再進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。
 

 

03 操作
實(shí)驗(yàn)員豐富的接種經(jīng)驗(yàn)極為重要，新手往往因經(jīng)驗(yàn)少而常出問(wèn)題。如實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備不夠充分，接種過(guò)程中手抖等。且新手實(shí)驗(yàn)員操作速度較慢而使接種時(shí)間延長(zhǎng)，使細(xì)胞活性下降進(jìn)而影響成瘤率。所以，新手要多多練習(xí)接種或請(qǐng)經(jīng)驗(yàn)豐富的人員完成接種環(huán)節(jié)。

接種部位及接種深度也極為重要。選擇血管豐富的區(qū)域接種，如腋窩部位或頸后方的肩胛骨上側(cè)皮下等。進(jìn)針時(shí)先用針頭刺破皮膚，持平注射器使針頭在皮下行進(jìn)一段距離，稍微上挑后開(kāi)始注射，注射過(guò)程中不可使針頭移行。注射結(jié)束后壓著針頭快速拔出，同時(shí)用棉簽輕壓進(jìn)針孔處以免有細(xì)胞液流出。
 

接種環(huán)節(jié)應(yīng)由一人完成所有動(dòng)物接種，避免同一實(shí)驗(yàn)多人。因每個(gè)人對(duì)卡尺的松緊和測(cè)量方向操作不同，為保持腫瘤體積測(cè)量的一致性，后續(xù)的量瘤環(huán)節(jié)也需要同一個(gè)人完成。

更多疑問(wèn)？
1）如何避免串狀腫瘤
抽取細(xì)胞后，可用酒精擦拭針頭，避免針頭上的腫瘤細(xì)胞沾到行針路徑上。

2）接種針有氣泡怎么辦?
多取適當(dāng)體積的液體，然后針尖朝上，往回吸一點(diǎn)，形成一個(gè)空間，再將空氣推出，同時(shí)有部分液體推出，氣泡即可以排除了。此時(shí)要注意腫瘤細(xì)胞比較粘，盡量排在紙上或者離心管里。

3）瘤子長(zhǎng)不出來(lái)是怎么回事？
一方面可能是細(xì)胞狀態(tài)差，活力不好，或是腫瘤細(xì)胞不易成瘤，需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細(xì)胞系；一方面可能是小鼠周齡太大，或小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（M-NSG小鼠＞NOD SCID小鼠＞裸小鼠）

4）小鼠瘤子長(zhǎng)起來(lái)又消失？
腫瘤塊先縮小，后變大很常見(jiàn)，很可能是炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被小鼠自身吸收，建議繼續(xù)觀察經(jīng)過(guò)幾周是否能長(zhǎng)出來(lái)，若否，則需要更換小鼠。

5）是否可以在一只小鼠進(jìn)行多個(gè)點(diǎn)荷瘤？
不可以，一只老鼠就只能接種一個(gè)點(diǎn)。因?yàn)橐粋�(gè)老鼠身上有多個(gè)腫瘤塊的情況下，可能會(huì)相互影響。