內(nèi)毒素-菌體中毒性物質(zhì)總稱

【名詞解釋】

• 熱原（Pyrogen）：凡是能造成生物機(jī)體體溫上升的物質(zhì)均可稱為熱原。

• 內(nèi)毒素（Endotoxi）：由革蘭氏陰性菌外層細(xì)胞膜在死亡或分裂時(shí)產(chǎn)生的物質(zhì)。主要成分為脂多糖（LSP, LipoPolySaccharide），其單位為Eu/mg或Eu/U）。內(nèi)毒素是一種熱原，其它可造成體溫升高的熱原還有如：革蘭氏陰性菌的肽葡萄糖（Peptidoglycan），脂磷壁酸質(zhì)（lipoteichoic），物胞壁酰肽（muramyl  peptides），寄生蟲(chóng)等。

各種細(xì)菌的內(nèi)毒素的毒性作用較弱，大致相同，可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等。內(nèi)毒素耐熱而穩(wěn)定，抗原性弱�？纱碳�機(jī)體產(chǎn)生抗體，但無(wú)中和作用，形成抗毒素，經(jīng)甲醛處理不能成為類(lèi)毒素。

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對(duì)宿主是有毒性的。雖然內(nèi)毒素緊密地嵌入細(xì)胞壁中，但也會(huì)不斷地向周?chē)�環(huán)境釋放內(nèi)毒素，這種釋放不僅僅是因?yàn)榧?xì)胞的解體和死亡造成的，也會(huì)發(fā)生在正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂過(guò)程中。

內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì)，因此非常耐熱。在100℃的高溫下加熱1小時(shí)也不會(huì)被破壞，只有在160℃的溫度下加熱2到4個(gè)小時(shí)，或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。與外毒素不同之處在于：內(nèi)毒素不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類(lèi)毒素；把內(nèi)毒素注射到機(jī)體內(nèi)雖可產(chǎn)生一定量的特異免疫產(chǎn)物（稱為抗體），但這種抗體抵消內(nèi)毒素毒性的作用微弱。
 

TWO
 

內(nèi)毒素檢測(cè)方法選擇的考量

（檢測(cè)原理）

內(nèi)毒素的檢測(cè)方法有哪些？

1. 凝膠法簡(jiǎn)便易操作，有可能無(wú)法排除干擾作用；若樣品稀釋到MVD仍不能排除干擾作用，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)供試品的前處理進(jìn)行研究，再用干擾試驗(yàn)驗(yàn)證是否能用凝膠法。

2. 光度法包括濁度法和顯色法，可定量檢測(cè)內(nèi)毒素的含量。能較為準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中污染的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢(shì)，還能起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的作用，更易達(dá)到數(shù)據(jù)完整性的要求。

3. 凝膠法常用的反應(yīng)容器為玻璃小試管或安瓿瓶；光度法常用的反應(yīng)容器為測(cè)定儀器專用的試管或酶標(biāo)板。

鱟試劑凝膠法檢測(cè)原理圖示

（圖片來(lái)源：https://kepleybiosystems.com/hcrbi,侵刪）

內(nèi)毒素檢測(cè)注意事項(xiàng)

1. 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏度和自身凝集時(shí)間，因?yàn)轺c試劑本身靈敏度的改變或質(zhì)量不符合要求，能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2. 細(xì)菌內(nèi)毒素工作品效價(jià)誤差或不穩(wěn)定，可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3. 嚴(yán)格使用廠家配備的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水。

4. 實(shí)驗(yàn)操作誤差：操作順序和熟練程度尤為重要。一般順序：制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液、稀釋樣本、溶解鱟試劑、擺放試管、加樣或加試劑、封口恒溫、觀察結(jié)果并記錄。

5. 實(shí)驗(yàn)器具的潔凈度影響：硫酸浸泡4h，蒸餾水沖洗，干熱滅菌。

6. 實(shí)驗(yàn)條件：潔凈、無(wú)塵�？諝饬魍ā�

7. 溫度：室溫25±2℃，恒溫水浴溫度為37±1℃。

樣本自身干擾，對(duì)含有多糖類(lèi)藥品或培養(yǎng)基上清，應(yīng)選用特異性鱟試劑或普通鱟試劑+G因子抑制劑。pH不在檢測(cè)范圍內(nèi)的及時(shí)調(diào)整。

 

內(nèi)毒素檢測(cè)的影響因素

試驗(yàn)條件與操作：培養(yǎng)條件、操作環(huán)境可能引起各次實(shí)驗(yàn)之間、各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果差異。

1. 時(shí)間：鱟試劑在液態(tài)時(shí)不穩(wěn)定，室溫放置太久會(huì)影響反應(yīng)靈敏度，加樣結(jié)束后，應(yīng)立即放入恒溫水浴中，延長(zhǎng)保溫時(shí)間，可提高LAL的靈敏度。5分鐘混合點(diǎn)的活性最強(qiáng)，混合時(shí)間越長(zhǎng)，活性反而降低，但在三十分鐘以內(nèi)的各混合時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的靈敏度均在規(guī)定范圍內(nèi)。在顯色法中靈敏度與時(shí)間有關(guān)，實(shí)驗(yàn)中既要嚴(yán)格控制每個(gè)環(huán)節(jié)的保溫時(shí)間，又要嚴(yán)格控制終止時(shí)間。

2. 溫度：凝膠試驗(yàn)規(guī)定的孵化溫度為37℃，實(shí)驗(yàn)證明，保溫在25-41℃，隨著溫度的升高，LAL的靈敏度也隨著升高，在41-46℃之間，對(duì)靈敏度無(wú)明顯影響；≥48℃會(huì)破壞鱟試劑。

3. pH值：鱟試劑的pH作用區(qū)間是6-8之間，7.0-7.5最佳。

4. 試驗(yàn)耗材：內(nèi)毒素稀釋不宜用注射器，應(yīng)使用經(jīng)過(guò)校正的刻度吸管。且針?biāo)�膠塞容易吸附內(nèi)毒素而使其濃度不夠，造成凝膠反應(yīng)不成立。

5. 操作程序：加樣次序可能會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立等問(wèn)題。

   供試品

6. 多糖：β-葡聚糖可以激活G因子使得結(jié)果呈陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)室常用的酒精、棉球等含有較多的葡聚糖，低于一定濃度的葡聚糖或LAL-RM（反應(yīng)物）不足以使鱟試劑的凝集反應(yīng)產(chǎn)生陽(yáng)性，但如果有細(xì)菌內(nèi)毒素共同作用的情況下，凝集反應(yīng)會(huì)變得更為激烈和迅速，很容易使反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

7. 蛋白：

   〖陽(yáng)離子蛋白〗：溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G能夠與細(xì)菌內(nèi)毒素形成細(xì)菌內(nèi)毒素-蛋白復(fù)合體，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用，從而影響用鱟法來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素。在測(cè)定之前使用蛋白酶K來(lái)消化樣品，可使細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率達(dá)到百分之百。

   〖血紅蛋白〗：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活G因子。研究表明使用一般鱟試劑測(cè)定人血白蛋白、球蛋白等血液制品的陽(yáng)性檢出率明顯高于用去G因子LAL測(cè)定的陽(yáng)性率，而后者與兔熱原檢查結(jié)果基本一致。

   〖免疫蛋白〗：免疫球蛋白可以激活G因子途徑。

8. 離子：離子強(qiáng)度較大會(huì)引起內(nèi)毒素的聚集，加重低濃度內(nèi)毒素不易分散的問(wèn)題；另外LAL中的C因子必須在二價(jià)陽(yáng)離子的參與下才能被激活形成活化的C因子。研究發(fā)現(xiàn)鎂離子增強(qiáng)了LAL顯色反應(yīng)，鈣離子濃度大于5mmol/L時(shí)抑制反應(yīng)。當(dāng)溶液中含有EDTA等絡(luò)合劑或抗凝劑時(shí)，陽(yáng)性離子會(huì)失去作用，也就會(huì)影響測(cè)定。

9. 有機(jī)鹽：核酸鈉能像內(nèi)毒素一樣被檢出，出現(xiàn)假陽(yáng)性干擾。

10. 透析液：鱟試劑測(cè)定透析液中的內(nèi)毒素方法待進(jìn)一步考察。

11. 中藥成分：清熱解毒類(lèi)藥物等能夠干擾LAL試驗(yàn)。

12. 生化藥品：氨基酸對(duì)鱟試劑有較強(qiáng)的抑制作用。

13. 其它物質(zhì)：多種凝血因子、蛋白質(zhì)變性物質(zhì)、高糖溶液、絡(luò)合物、電解質(zhì)、維生素、添加劑等都會(huì)干擾鱟試劑形成凝膠。

14. 鱟試劑內(nèi)源性因子：試劑盒內(nèi)部因子干擾。

15. 試劑質(zhì)量：批次、溶解水、靈敏度等。

16. 處理作用：不同產(chǎn)品處理和儲(chǔ)存條件可能為出現(xiàn)分析的誤差，鱟試劑溶解后的保存條件等。

歡迎關(guān)注公眾號(hào)留言咨詢，給您最合適的解決方案~