細胞實驗和動物實驗過程中的給藥劑量和注意事項
小白：拿到產(chǎn)品后都不知所措了，之前拿到的產(chǎn)品一不小心就選錯了溶劑，直接廢掉不能用了，扔掉的都是白花花的經(jīng)費啊。
師兄：拿到產(chǎn)品不能想當然的就動手，要多查資料查文獻�？茖W研究一切都是要有理有據(jù)有出處的，即使沒有相關文獻也是需要查閱大量相似資料奠定理論基礎，設置梯度來摸索的。一切都是不容易的。
萌 Cece：給藥是個大工程，需要大量的理論基礎和文獻參考，只有站在巨人的肩上，我們才能看的更遠，走的更久
不同的產(chǎn)品，不同的給藥方式和給藥劑量，即使是同一產(chǎn)品，不同的細胞，不同動物模型，給藥劑量也是不一樣的。拿到產(chǎn)品后，我們要根據(jù)產(chǎn)品名字和自己的實驗設計，有目的的去查文獻。
■ 細胞實驗，劑量如何查詢
細胞實驗一般是將小分子藥物加入培養(yǎng)基，與細胞共孵育來發(fā)揮作用的。給藥劑量查詢?nèi)缦滤荆?/span>輸入產(chǎn)品名字，細胞系名稱，劑量單位(小分子抑制劑一般用量在 µM 的比較多，重組蛋白類的一般用量在 ng/mL 的范圍)，文獻搜索后，參考文獻的使用濃度和使用時間，設計自己的實驗。
Tips: 也會有小伙伴遇到自己的細胞系沒對應文獻的情況，建議根據(jù)其他細胞系文獻的使用劑量，設置梯度進行 “劑量-效應” 曲線預實驗，確定合適的使用濃度再進行后續(xù)的功能研究。
圖 1. 細胞實驗文獻查閱
■ 當小分子抑制劑遇到轉染
當然，并不是所有的劑量組都只有小分子化合物，有些伙伴可能會糾結 “我還要給細胞轉染，這個時候我要怎么加藥呢？” “除了小分子抑制劑，我要加我自己合成的其他藥物，該是怎樣怎么加藥呢？”
如下面這篇文章里，作者團隊探究 κ 阿片受體 (KOR) 在 食管鱗狀細胞癌 (ESCC) 中的作用及其潛在機制，研究者前期使用 siRNA 敲低 KOR 表達，發(fā)現(xiàn) KOR 下調(diào)增強了 ESCC 細胞的增殖、轉移和侵襲能力。激活 PI3K -Akt 通路對腫瘤細胞（經(jīng) siRNA 敲低 KOR 表達處理）的增殖有促進作用，為探究 AKT 的激活是否是導致轉染 siRNA-KOR 的腫瘤細胞的增殖、入侵和遷移的原因，使用小分子抑制劑 HY-10249A (0.5 μM) 對其進行處理[1]。
注意文獻這里的描述：“following KOR knockdown”，小分子抑制劑是在轉染之后加的，HY-10249A ，AKT 激酶抑制可以逆轉 KOR 的抑制對細胞增殖、侵襲和遷移的影響。
圖 2. 細胞實驗文獻查閱
圖 3. AKT 激酶抑制可以逆轉 KOR 的抑制對細胞增殖、侵襲和遷移的影響[1]
敲黑板: 請注意，這里是案例，實際給藥還需多多參考文獻！
關注關注文獻中的 Method 部分，搜索關鍵字以及做好整理。
搜關鍵字以及做好整理。常見關鍵字 Pretreatment，co-treatment, following, before treatment 等等。動物實驗的給藥方式包括口服，灌胃，注射 (皮下注射，皮內(nèi)注射，靜脈注射，腹腔注射，肌肉注射等)，具體可參考小 M 的往期推文：給藥方式猶豫不決？不看你就虧了。
在動物實驗給藥之前，首先明確自己的實驗動物和實驗模型，再用關鍵字查閱文獻選擇合適的給藥方式進行實驗設計。如下所示：
在查閱文獻的網(wǎng)站搜索框中輸入產(chǎn)品名稱，動物模型，劑量單位(小分子類產(chǎn)品一般 mg/kg 較多)，搜索文獻，搜到文獻后參考文獻劑量設置梯度進行就可以啦！
還是以 LY294002 為案例，假設你用的小鼠是 BALB/c 小鼠，準備做乳腺癌相關研究，那么你可以關鍵字可以這樣設置！“LY294002 breast tumor BALB/c mg/kg” 或者 “LY294002 breast cancer BALB/c mg/kg”。
好了，查到大量文獻后，請進入閱讀學習模式！
圖 4. 動物實驗文獻查閱
還有這樣一種情況，可能你查到的文獻都是小鼠，但實際你要做的是大鼠，但是找不到文獻支持，下面策略可以考慮:
匯總好查閱的關于小鼠的給藥劑量的文獻。
使用常見物種給藥劑量的相互換算，如下表 1 所示，根據(jù)公式 Animal rat (mg/kg) = Animal mouse (mg/kg) multiplied by (Animal mouse Km/Animal rat Km)。即大鼠體內(nèi)的給藥劑量為小鼠給藥劑量的一半 (請注意，嚴謹起見，設置濃度梯度劑量組)[2]。
實驗方案確定好了之后，下一步就是藥物溶解了。
■ 友好溶劑：水
水溶性的產(chǎn)品，細胞實驗時可以用純 ddH2O 配置 20-100 倍的儲液，使用時培養(yǎng)基稀釋到工作液濃度后 0.22 µm 濾膜過濾。
■ 溶解界老大哥：萬能溶劑 DMSO
很多產(chǎn)品并不溶于水，這時候，我們的萬能溶劑 DMSO 就閃亮登場了。
細胞實驗可以根據(jù)您的最大使用濃度，配置 1000X 的儲液，使用時培養(yǎng)基稀釋到工作液濃度。
Tips: 有時候可能會遇到產(chǎn)品本身溶解度不高的情況，無法配置 1000X 的儲備液；要做好溶劑對照，排除下 DMSO 對實驗結果的影響。
但溶劑的選擇，也不能想當然是 DMSO，前切記切記多看說明書。
注：MCE 說明書的溶解方案都是實測數(shù)據(jù)。有些產(chǎn)品很有可能是萬能溶劑也溶解不了，番茄紅素為例，它的溶劑是 THF 四氫呋喃。此外，其他有機溶劑 DMF (鉑類物質的好朋友)，丙酮等，雖相對 DMSO 使用較少，但它們還是藥物溶解的好溶劑！見往期推文：溶劑大比拼—細胞實驗篇。
■ 友好溶劑：水或者生理鹽水
您如果選擇 PBS 或生理鹽水配置，溶解度參考水中的溶解信息，配置好后 0.22 µm濾膜過濾，直接使用不可儲存。因 PBS 或生理鹽水的成分相對復雜，長期儲存不確定是否會影響產(chǎn)品活性，所以不建議用 PBS 或生理鹽水陪住儲液。
動物實驗時，您可以根據(jù)水中的溶解度信息，選擇用雙蒸水配置 10 倍的儲液，使用時 PBS 或生理鹽水稀釋 10 倍；如果溶解度受限，無法配置 10X 的水中溶解度，需用 PBS 或生理鹽水現(xiàn)配現(xiàn)用。
■ 對于有機溶劑溶解的產(chǎn)品（如 DMSO）
正常小鼠可用 DMSO 配置至少 10 倍的儲液，使用時加助溶劑稀釋 10 倍，做好溶劑對照就可以了。
在這里給大家安利一個小工具！進入公眾號打開 “實用工具-溶解度計算器”，輸入產(chǎn)品貨號，輸入小鼠體重，給藥體積，小鼠數(shù)量以及給藥周期：
■ 免疫缺陷鼠，如裸鼠，NGS 小鼠等體弱小鼠，一般建議配置至少 50X 的儲液。
可能有小伙伴要問：50X，這是什么意思？此處以Rapamycin (HY-10219) 為例，一般小鼠體內(nèi)的給藥劑量在 1-10 mg/kg。假設給藥 8 mg/kg [3]，小鼠體重為 20 g，腹腔注射，200 µL 的給藥體積。
我們最終的工作液濃度是 0.8 mg/mL，50X，就是配置 40 mg/mL 的儲液 (此產(chǎn)品在 DMSO 中的溶解度為 125 mg/mL，可以滿足），使用時按照 2% DMSO+40% PEG300+5% Tween 80+53% saline 稀釋給藥。
動物實驗中，有些模型給藥劑量較大，可能無法配置 10X 或者 50X 儲備液，那么需要考慮現(xiàn)配現(xiàn)用的方案，比如 0.5% CMC-Na/saline (HY-Y0703），50% PEG 300 (HY-Y0873) +50% saline 等方案可選 (詳見往期推文：動物實驗溶劑大 Battle！)。
但無論哪種實驗方案，建議使用前先取少量嘗試，能達到澄清溶液或均勻的混懸液，腹腔和口服給藥都是可以的。
生物實驗是一個不斷摸索和嘗試的過程，給藥劑量，給藥方式，溶解方案等都是要在文獻的基礎上摸索，這樣才能達到事半功倍的效果。以上是萌 Cece 對溶解，給藥等的一些建議，僅供參考。
最后，萌 Cece 祝大家實驗順利，paper 多多~
參考文獻
[1] Cell Commun Signal. 2022;20(1):35. Published 2022 Mar 19.
[2] Arch Physiol Biochem. 2022 Apr;128(2):426-430. PMID: 31746232.
[3] Elife. 2016 Aug 23;5:e16351.PMID: 27549339.
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