實驗描述了將斑馬魚幼蟲包埋在低百分比低熔點瓊脂糖中用于延時顯微鏡的過程。根據(jù)科學(xué)問題，可以在瓊脂糖包埋的幼蟲中觀察到不同的發(fā)育階段：這可以包括絨毛膜發(fā)育的最初 48 小時，或孵化后的時間（受精后 48-120 小時）。
 

1. 材料和設(shè)備
1.1. 動物

•斑馬魚幼蟲（受精后長達(dá) 120 小時）

1.2. 設(shè)備

•熱混合器（例如 Eppendorf、ThermoMixer C）

•µ-Slide 2 孔共培養(yǎng)，ibiTreat（81806）

•塑料移液器

•可選：小刷子

•顯微鏡
 

2. 程序
準(zhǔn)備工作

在開始實驗之前，請按照“緩沖區(qū)和解決方案”部分中的說明準(zhǔn)備 LMPA。保持在 35°C 直至需要。如果預(yù)先準(zhǔn)備好瓊脂糖，請在熱混合器中重新加熱等分試樣 (~80°C)，然后讓瓊脂糖冷卻 (~35°C)。

安裝

請在使用 µ-Slide 2 Well Co-Culture 之前閱讀說明。

在我們小組的一些實驗中，機(jī)械損傷被誘導(dǎo)到斑馬魚脊髓。如果這樣做，建議讓幼蟲在安裝前至少恢復(fù) 30 分鐘。脊髓橫斷后，嵌入瓊脂糖后的初始存活率為 80%。所有這些幼蟲也在瓊脂糖中存活了 48 小時的觀察期。未受傷幼蟲的初始存活率接近 100%。

1.在 Tricaine Use Solution 中麻醉斑馬魚幼蟲 2 分鐘。

2.使用塑料移液器將一只幼蟲放入每個 µ-Slide 2 孔共培養(yǎng)室中，加入一點多余的魚水。

3.對每個幼蟲分別執(zhí)行以下步驟（以避免變干）：

3.1.用塑料移液管去除所有魚水。

3.2.將 50 µl LMPA 添加到小孔中以覆蓋幼蟲。

3.3.使用刷子或小移液器吸頭，將幼蟲定向到正確的位置（橫向位置，盡可能水平和筆直，對齊均勻，即始終面向左側(cè)，蛋黃在底部）。

4.讓 LMPA 凝膠凝固（0.5% 凝膠 ~ 20–30 分鐘）。

5.可選：用600µl 1x含80 mg/l三卡因原液的魚水覆蓋固化的LMPA凝膠，用于在成像過程中進(jìn)行連續(xù)麻醉。

6.用自帶蓋子蓋住 µ-Slide 2 Well Co-Culture 以避免蒸發(fā)。

7.安裝的斑馬魚幼蟲現(xiàn)在可以進(jìn)行成像了。

在瓊脂糖頂部添加魚水是可選的，因為如果蓋子緊閉，標(biāo)本在 48 小時的成像過程中不會變干。這也使正置顯微鏡觀察沒有溢出的風(fēng)險。
 

圖 1：在 µ-Slide 2 Well Co-Culture 中嵌入 LMPA 的斑馬魚幼蟲
 

3.延時顯微鏡觀察

這種樣品制備程序可用于連續(xù)延時顯微鏡以及不同時間點的某些視野的光學(xué)顯微鏡設(shè)備。

圖 2：A) 整個 µ-Slide 2 Well Co-Culture 與總共 18 只斑馬魚幼蟲在受精后 72 小時，嵌入瓊脂糖后 3 小時的明場平鋪掃描。

 

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