文章導(dǎo)讀

• 單一蛋白質(zhì)樣品的分離、純化？
• 單一蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定？
• 蛋白質(zhì)混合物質(zhì)譜鑒定方法？

對(duì)于單一蛋白的常用鑒定方法，大家肯定立馬想到免疫印跡法（Western Blot）。Western Blot是通過抗體和目標(biāo)分子的特異性結(jié)合從而對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定，但是這種方法是適用于對(duì)已知蛋白進(jìn)行鑒定，并且必須借助抗體，所以不適用于對(duì)未知或者沒有相應(yīng)抗體的蛋白進(jìn)行分析。那么小伙伴們可能要問了，如果自己要研究的蛋白質(zhì)是未知的或者目前沒有可用抗體怎么辦呢？在這種情況下，就可以借助質(zhì)譜鑒定技術(shù)來對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定了。在這期中小編就給大家整理了蛋白質(zhì)鑒定的相關(guān)知識(shí)，希望對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定一直有困惑的同學(xué)能有幫助。

一、單一蛋白質(zhì)分離純化

提到單一蛋白樣品，顧名思義在這類蛋白樣品應(yīng)該已經(jīng)經(jīng)過了一定的蛋白純化步驟，獲得了相對(duì)單一的蛋白。通常通過細(xì)胞裂解或者體外合成的蛋白質(zhì)都包含其他的雜蛋白，因此需要將目的蛋白與雜蛋白區(qū)分開，常用的蛋白分離純化方法便是電泳分離。一維電泳分離利用蛋白質(zhì)大小不同的特性，能夠很好的將不同分子量的蛋白進(jìn)行區(qū)分，另外，再次基礎(chǔ)之上二維電泳能夠進(jìn)一步將不同帶點(diǎn)量的蛋白分子進(jìn)行區(qū)分。

1. 一維電泳
目前普遍采用的一維電泳為垂直板聚乙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE膠），其原理是不同濃度的乙烯酰胺在聚合后會(huì)產(chǎn)生具有一定孔徑大小的凝膠，接著在緩沖液中加入SDS表面活性劑中和蛋白質(zhì)表面的電荷，當(dāng)變性的蛋白質(zhì)混合樣品通過凝膠空隙的時(shí)候，不同分子量大小的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移的速度不同因而被分離開來。一維電泳能夠分離對(duì)大多數(shù)蛋白和蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行初步分離。

圖1. 蛋白質(zhì)一維電泳分離

2. 二維電泳
二維電泳，也稱為雙向電泳，是在一維電泳的基礎(chǔ)上加入了橫向的等電聚焦分離，而其縱向的分離與一維SDS分離方法完全一樣。二維電泳首先利用蛋白等電點(diǎn)不同的特性，對(duì)蛋白進(jìn)行初步分離，接著再根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同，再進(jìn)一步對(duì)等電點(diǎn)相同或相近的蛋白質(zhì)進(jìn)行二維分離，進(jìn)一步提升蛋白質(zhì)分離效率。二維電泳的蛋白分辨率相比一維電泳已經(jīng)大幅度提升，經(jīng)過二維電泳分離后大部分蛋白質(zhì)都能夠被分離為含有單一的蛋白質(zhì)蛋白膠點(diǎn)。

圖2. 蛋白質(zhì)二維電泳分離

二、單一蛋白質(zhì)鑒定

目前對(duì)純度較高，或單一蛋白質(zhì)的鑒定的方法有蛋白質(zhì)指紋譜鑒定（PMF）和MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定法。這兩種方法都是先將蛋白質(zhì)酶切成多肽片段，再利用質(zhì)譜儀對(duì)肽段分析，達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)鑒定的目的。而兩種方法的不同之處就在于PMF法只使用一級(jí)質(zhì)譜對(duì)蛋白肽段進(jìn)行檢測(cè)，而MS/MS不僅經(jīng)過一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，并且在此基礎(chǔ)上選取特定肽段進(jìn)行肽段破碎，對(duì)肽段的序列進(jìn)行測(cè)定。因此MS/MS比PMF的鑒定準(zhǔn)確度更高，與數(shù)據(jù)庫比對(duì)的可靠性更高，但分析起來的也更為復(fù)雜。

1. 蛋白質(zhì)指紋譜鑒定（PMF）
由于蛋白質(zhì)序列的不同，因此不同的蛋白質(zhì)在同一種消化酶的作用下酶切產(chǎn)生的多肽片段大小質(zhì)量是特異的。蛋白質(zhì)指紋譜鑒定法正是利用了每種蛋白酶切產(chǎn)生的太片段不同的特性，對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切處理，再對(duì)酶切產(chǎn)生的肽片段的質(zhì)量進(jìn)行分析，即可獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量譜圖。再將肽譜圖與數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)理論肽譜圖進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而可獲知蛋白質(zhì)的身份信息。

2. MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜法
串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）檢測(cè)蛋白的原理是先使用一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)肽段的質(zhì)量信息，再選取峰值高的肽段進(jìn)行破碎，分析獲得二級(jí)質(zhì)譜。用檢索軟件選擇相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同時(shí)以打分的形式評(píng)判鑒定結(jié)果，當(dāng)打分大于某個(gè)閾值時(shí)，即判定質(zhì)譜鑒定成功，反之則鑒定失敗。

三、蛋白混合物鑒定

雖然目前有多種蛋白質(zhì)分離純化的方法，但在很多時(shí)候分離效率不夠高，導(dǎo)致分離后的蛋白可能還是含有多個(gè)蛋白。另外，對(duì)于豐度較低的蛋白質(zhì)可能在分離過程中造成進(jìn)一步損失而無法被鑒定到，因此需要直接對(duì)這一類蛋白質(zhì)不經(jīng)過分離處理直接進(jìn)行分析。目前適用于對(duì)混合蛋白進(jìn)行分析的方法有LC-MS/MS色譜質(zhì)譜串聯(lián)分析法。與PMF法和MS/MS法相比，LC-MS/MS在質(zhì)譜分析前加了液相色譜的分離，使得蛋白分析精度更高，對(duì)肽段序列測(cè)定幾乎可以的達(dá)到100％的準(zhǔn)確度。因此，與單個(gè)蛋白質(zhì)膠帶的鑒定相比，這項(xiàng)服務(wù)的可以鑒定的蛋白數(shù)量也更多。LC-MS/MS可以用于鑒定200個(gè)蛋白質(zhì)左右的蛋白混合物樣品，包括免疫沉淀樣品，Pull-down樣品等。

圖3. 三種蛋白質(zhì)鑒定法比對(duì)

百泰派克技術(shù)平臺(tái)

檢測(cè)分析平臺(tái)：多臺(tái)高分辨率質(zhì)譜儀、高效液相色譜、氣相色譜，NMR。

蛋白質(zhì)組分析平臺(tái)：Label-free、iTRAQ、SILAC、SWATH、MRM；蛋白質(zhì)定性定量鑒定、蛋白質(zhì)差異分析、發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)記物、發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)。

代謝組分析平臺(tái)：靶向代謝組學(xué)、非靶向代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)分析；通量達(dá)1000種代謝分子、代謝通路分析、代謝靶標(biāo)鑒定。流式細(xì)胞多因子檢測(cè)平臺(tái)：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細(xì)胞因子。

蛋白質(zhì)從頭測(cè)序平臺(tái)：Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀、PEAKS軟件分析；100%序列測(cè)定，精準(zhǔn)蛋白、抗體測(cè)序。

生物制藥分析平臺(tái)：生物藥物鑒定、變異性分析、純度分析。

流式細(xì)胞多因子檢測(cè)平臺(tái)：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細(xì)胞因子。