ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。該技術(shù)自70年代初問(wèn)世后迅速應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。
 

ELISA的原理，這一塊相信小伙伴們都是非常熟悉的了，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔（當(dāng)然就是我們熟知的96孔板啦）中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。
 

01
直接法原理

 

 

直接法是利用包被抗原，檢測(cè)抗體或者進(jìn)行重組蛋白的活性驗(yàn)證，利用蛋白與板材（即微孔板底）通過(guò)疏水鍵、流水/離子鍵的被動(dòng)吸附,通過(guò)引入其它活性基團(tuán)如氨基和碳基的共價(jià)結(jié)合，以及通過(guò)表面改性后的親水鍵結(jié)合等等，當(dāng)然也有利用親和素預(yù)包被的板材，通過(guò)親和素與生物素的共價(jià)結(jié)合及親和素有四個(gè)殘基理論可結(jié)合個(gè)生物素的特性，使結(jié)合的蛋白更多，靈敏度進(jìn)一步提高，目前只是該方法的成本會(huì)升高。
 

直接法相對(duì)來(lái)說(shuō)靈敏度和特異性較其他方法低，目前使用較少，通常用于重組蛋白或重組抗體的結(jié)合活性驗(yàn)證。而使用親和素包被的板材主要原因在于大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，當(dāng)然好的板材也是成功的一半，聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能。各方面表現(xiàn)較為均衡，是ELISA 反應(yīng)中最常用的固相載體。小分子蛋白由于吸附性較差，固使用這樣間接包被的形式才能起到理想的固定形式。
 

02
間接法原理

 

 

間接法相對(duì)直接法，靈敏度進(jìn)一步提升，利用一抗與抗原的特異結(jié)合，再加入通用二抗（即檢測(cè)抗體），如一抗使用的抗某蛋白的鼠抗，二抗可使用鼠/兔等抗該類型抗體（IgG）的抗體，利用抗體的特異性識(shí)別，加之顯色用的二抗非直接與抗原結(jié)合，所以稱之為間接檢測(cè)，該方法一般用于抗體的檢測(cè)，如重組抗體，或疫苗效價(jià)的檢測(cè)，咱們打疫苗的目的就是產(chǎn)生中和抗體嘛，該方法在IVD企業(yè)使用較多。
 

03
夾心法原理

 

夾心法使用的是兩個(gè)抗體夾抗原或者兩個(gè)抗原夾抗體的方法，這種復(fù)合物被稱之為三明治夾心結(jié)構(gòu)，利用一對(duì)配對(duì)完全的抗體，可以特異性檢測(cè)抗原，當(dāng)然主要針對(duì)的是具有至少2個(gè)以上抗原表位的抗原，畢竟有兩個(gè)抗體來(lái)結(jié)合嘛，抗體的配對(duì)可是門技術(shù)活，很多公司可以生產(chǎn)抗體，但是配對(duì)卻很少做，主要原因在于篩選的難度，可能開(kāi)發(fā)的幾十株針對(duì)同一抗原的抗體，都很難有一對(duì)合適的可以配對(duì)，原因是多方面的，有抗原的表位、構(gòu)象等原因，也有抗體效價(jià)的原因，當(dāng)然還有篩選成本的原因，所以每一個(gè)ELISA試劑盒都是經(jīng)過(guò)多次和長(zhǎng)期的驗(yàn)證得來(lái)的哦！且用且珍惜！
 

那么雙抗原夾抗體也就好理解了，是兩個(gè)抗原共同結(jié)合一個(gè)抗體，也是用于抗體的檢測(cè)啦！IVD最愛(ài)！
 

04
競(jìng)爭(zhēng)法原理

競(jìng)爭(zhēng)法的使用相對(duì)來(lái)說(shuō)就窄一點(diǎn)了，其原理是利用抗原抗體結(jié)合的可逆性（晶格學(xué)說(shuō)），但在合適濃度時(shí)又可達(dá)到結(jié)合和解離的穩(wěn)定期，那么親和力更強(qiáng)的抗體自然就能更有效的結(jié)合抗原了。一般結(jié)合的解離使用最多的就是SPR和BLI技術(shù)了，可以高精度或高通量的測(cè)抗原/抗體、受體/配體的親和力。
 

利用已知的抗原進(jìn)行標(biāo)記（抗原A），作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組加入樣本（抗原B）及標(biāo)記抗原，與對(duì)照組相比，顯色低，則該抗原A與抗原B競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，這種方法一般用于抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原。
 

包被抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)法呢，一般用于ADA，競(jìng)爭(zhēng)、非競(jìng)爭(zhēng)抗抗體鑒定/篩選，抗抗體的競(jìng)爭(zhēng)篩選是最有效的免疫原性檢測(cè)手段之一。

 

操作步驟

說(shuō)了這么多，原理小伙伴們應(yīng)該都非常清楚了，那么如何去做呢？Absin為大家整理了詳細(xì)的清單！強(qiáng)烈建議收藏！

樣本問(wèn)題
 

細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過(guò)離心去除；立刻檢測(cè)樣本。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于-20°C冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋（因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)用的BSA會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稀釋后影響減少）。
 

血清：使用血清分離管收集樣本，樣品室溫放置 30分鐘。離心 15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000 g。立即取出血清，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20°C冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋（因?yàn)檠�清�?huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稀釋后影響減少）。
 

血漿：使用 EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血?jiǎng)┦占�血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心 15 分鐘，轉(zhuǎn)速為1000 g，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20°C冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋（因?yàn)檠�清�?huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稀釋后影響減少）。
 

01
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作

 

使用前所有試劑和樣本需放置于室溫，靜置 15分鐘。建議所有的實(shí)驗(yàn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測(cè)。
 

洗滌液：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正�，F(xiàn)象；放置室溫，輕搖混勻，待結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液。依據(jù)所需用量計(jì)算濃縮洗滌液使用量，可將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成工作濃度的洗滌液。未用完的放4°C。
 

顯色劑：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量將顯色劑A 和顯色劑B 等體積混合，避光；在使用前15 分鐘準(zhǔn)備，現(xiàn)配現(xiàn)用；每孔需100 μL。
 

稀釋用緩沖液：依據(jù)所需用量計(jì)算濃縮稀釋劑使用量，可將濃縮稀釋劑用蒸餾水或去離子水稀釋配置成工作濃度的稀釋劑。
 

SA-HRP：如提供的為濃縮 SA-HRP ，則需使用稀釋用緩沖液（1×）稀釋配置成工作濃度的1×SA-HRP,每孔需100 μL。檢測(cè)抗體：將干粉離心至管底，檢測(cè)抗體的重溶體積請(qǐng)參考瓶身標(biāo)簽，用稀釋用緩沖液重懸至相應(yīng)體積。（未用完的檢測(cè)抗體溶液可保存于4°C冰箱。）
 

標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液重溶，重溶體積請(qǐng)參考瓶身標(biāo)簽，按說(shuō)明書(shū)制備標(biāo)曲所用的稀釋方式配置。
 

02
實(shí)驗(yàn)操作步驟

加樣：加一定稀釋的待檢樣品100 μL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。
 

加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋)100 μL。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌3次。
 

加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液100 μL，37℃10～30分鐘。
 

※  加入終止液后30 分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm 的吸光度值，設(shè)定540nm 或 570nm 作為校正波長(zhǎng)。如果沒(méi)有使用雙波長(zhǎng)校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會(huì)受影響；

※  計(jì)算結(jié)果：將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD 值。使用計(jì)算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對(duì)數(shù)與相應(yīng)OD 值對(duì)數(shù)生成曲線，并通過(guò)回歸分析確定最佳擬合線。這個(gè)過(guò)程可生成一個(gè)足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。

 

注意事項(xiàng)

1）正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
 

2）實(shí)驗(yàn)材料的保存比較重要，一般需要注意的點(diǎn)如下：
 

※  ELISA試劑盒一般是4℃保存，如果有溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品次日需要使用，則需要-20℃，防止降解導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)；
 

※  未使用的標(biāo)準(zhǔn)品與未用完的試劑盒一起保存，一般試劑盒拆分后建議一周內(nèi)使用，由于濕度等影響，長(zhǎng)期放置易引起產(chǎn)品的不穩(wěn)定；
 

※  對(duì)于洗滌，常規(guī)建議機(jī)洗，有些較為老款的洗板機(jī)由于時(shí)間較久，可能加液沖力較大或有固定的洗滌液，可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果異常，需慎重選擇；
 

※  ELISA試劑盒正式實(shí)驗(yàn)前，建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，避免出現(xiàn)濃度超出檢測(cè)限導(dǎo)致的結(jié)果無(wú)法使用的情況；
 

※  各家試劑盒可能略有差異，使用前建議詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。