心力衰竭(HF)是心肌梗死(MI)的常見(jiàn)后果。通過(guò)鑒別MI后不同階段炎癥細(xì)胞的組成可能為建立新的生物標(biāo)志物和治療方法提供線索。本研究通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，探索MI小鼠模型中與心肌梗死相關(guān)的免疫細(xì)胞時(shí)空動(dòng)態(tài)。通過(guò)scRNA-seq鑒定出12個(gè)主要的免疫細(xì)胞群，并且這些細(xì)胞群的比例在MI后發(fā)生動(dòng)態(tài)改變。其中巨噬細(xì)胞是最豐富的群體（>為60%，除心肌梗死后第1天外）。通過(guò)軌跡分析發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后晚期巨噬細(xì)胞中Trem2的表達(dá)上調(diào)，體內(nèi)注射可溶性Trem2可顯著改善梗死心臟的功能和結(jié)構(gòu)。本研究有助于更好地理解心肌梗死驅(qū)動(dòng)的免疫反應(yīng)，并且通過(guò)進(jìn)一步研究Trem2信號(hào)通路的調(diào)控因子，將有利于探索心肌梗死后心衰的新治療策略。

 

文章題目：Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2hi macrophages in infarcted hearts

中文題目：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序--揭示心肌梗死中巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的時(shí)空動(dòng)力學(xué)和Trem2hi巨噬細(xì)胞的潛在功能

發(fā)表日期：2022.08

期刊名稱：Nature communications

影響因子：17.694

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Chromium 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、10x Genomics 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

DOI：10.1038/s41467-022-32284-2.

 

研究?jī)?nèi)容

• 心肌梗死后的免疫細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究

為了獲得心臟缺血損傷后免疫細(xì)胞圖譜，研究者分別在MI后第1、3、5和7天通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分離小鼠CD45+白細(xì)胞（梗死和梗死周圍區(qū)域）并進(jìn)行scRNA-seq測(cè)序。將處于穩(wěn)態(tài)（MI前）的CD45+細(xì)胞作為對(duì)照。所有時(shí)間點(diǎn)共捕獲33977個(gè)細(xì)胞，聚類注釋后得到12個(gè)的細(xì)胞簇(cluster)。其中最豐富的細(xì)胞群是巨噬細(xì)胞。在MI前，巨噬細(xì)胞占比最高，但在MI后第1天急劇下降，從MI后第3天開(kāi)始恢復(fù)，在MI后第7天達(dá)到峰值。相反，中性粒細(xì)胞的比例在第1天增加，然后迅速下降。一些其他細(xì)胞類型也呈時(shí)間依賴性變化，例如，單核細(xì)胞在MI早期（第1天和第3天）增加，在MI晚期（第5天和第7天）減少；淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和ILC2細(xì)胞)在MI第1天下降，直到MI后第7天才達(dá)到穩(wěn)定值。單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)表明，不同的細(xì)胞群在心肌梗死后的隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化具有差異。

 

• 心肌梗死后免疫細(xì)胞的時(shí)空分布

為了驗(yàn)證上述浸潤(rùn)到梗死區(qū)域的免疫細(xì)胞，研究者對(duì)心肌梗死后第1、3、5和7天的冷凍樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（ST-seq），在每個(gè)樣本中確定4-5個(gè)細(xì)胞簇。接下來(lái)進(jìn)一步研究每個(gè)spot中的細(xì)胞類型組成。結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞在MI后第1天高度浸潤(rùn)到梗死區(qū)域，但隨后數(shù)量迅速減少（在MI第3、5和7天）；巨噬細(xì)胞從MI后第3天開(kāi)始浸潤(rùn)到梗死區(qū)域，其豐度在心肌梗死晚期達(dá)到高峰（MI后第5天和第7天）；單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也以時(shí)間依賴性的方式浸潤(rùn)心臟梗死區(qū)域；其他免疫細(xì)胞群（如B和T細(xì)胞群）豐度非常低，分散在整個(gè)小鼠心臟（不聚集在梗死區(qū)域）。MI后不同時(shí)間點(diǎn)的ST-seq與scRNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，結(jié)果說(shuō)明心肌梗死早期單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到梗死區(qū)域，而巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的作用相反。

 

• 心肌梗死后單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性及其時(shí)間動(dòng)態(tài)改變

scRNA-seq結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞是心臟中最大的免疫細(xì)胞群體。為了進(jìn)一步了解MI后巨噬細(xì)胞亞型的動(dòng)態(tài)變化，研究者進(jìn)行了亞聚類分析，共獲得了16個(gè)亞細(xì)胞群。其中3個(gè)巨噬細(xì)胞亞簇（簇1、3和13）在MI前細(xì)胞占比高，研究者將其命名為穩(wěn)態(tài)巨噬細(xì)胞(SS-Mφ)簇。差異基因分析顯示，SS-Mφ1（簇3）中，Lyve1、F13a1等巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)升高；SS-Mφ2簇（簇1）顯示出相對(duì)較高的抗原呈遞相關(guān)基因的表達(dá)；在SS-Mφ3簇（簇13）中均檢測(cè)到SS-Mφ1和SS-Mφ2的標(biāo)記基因，表明這些細(xì)胞處于介于SS-Mφ1和SS-Mφ2簇之間的中間狀態(tài)。在MI早期階段（第1和3天），單核細(xì)胞和兩個(gè)巨噬細(xì)胞簇細(xì)胞在單核/巨噬細(xì)胞總數(shù)中占比高（簇4、10和14），稱為Early-Mφ簇。在MI晚期（第5和7天），4個(gè)巨噬細(xì)胞簇占比高（SS-Mφ1、SS-Mφ2、簇2和簇5），稱為L(zhǎng)ate-Mφ簇；此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)巨噬細(xì)胞群體，2個(gè)富含干擾素刺激基因的巨噬細(xì)胞群體，以及2個(gè)增殖群體（比例較低），這些細(xì)胞群在簇6和簇15中富集，表達(dá)許多與干擾素信號(hào)相關(guān)的基因，如Irf7、Isg15和Ifit2，因此被定義為IFN-Mφ。以上亞聚類分析揭示了巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性，以及巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的時(shí)間動(dòng)態(tài)改變，Late-Mφ和SS-Mφ簇可能在減弱心肌梗死后的炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織修復(fù)方面具有重要功能。

 

• 梗死心臟的單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡

為了更好地了解單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到梗死區(qū)域的過(guò)程，研究者使用Monocle R包進(jìn)行軌跡分析。結(jié)果顯示，以Ly6c2hi單核細(xì)胞為根時(shí)，細(xì)胞按Early-Mφ、Transient-Mφ和Late-Mφ的順序增加。然而，Transient-Mφ1和IFN-Mφ種群在相對(duì)較早的時(shí)間內(nèi)發(fā)生了分化，而Transient-Mφ1與Late-Mφ沒(méi)有聯(lián)系。接下來(lái)研究每個(gè)細(xì)胞群中特異性表達(dá)的基因隨時(shí)間的變化。結(jié)果顯示：Early-Mφ特異性基因在Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中表達(dá)上調(diào)，然后在Transient-Mφ中逐漸降低，在Late-Mφ細(xì)胞中達(dá)到低水平。相反，Late-Mφ特異性基因在Ly6c2himonocytes/Early-Mφ中下調(diào)，然后在瞬時(shí)Mφ和Late-Mφ細(xì)胞中逐漸上調(diào)。值得注意的是，在梗死的心臟組織中使用ST-seq檢查基因的表達(dá)以及巨噬細(xì)胞亞群的比例時(shí)發(fā)現(xiàn)，每個(gè)亞群的標(biāo)記基因和比例以時(shí)間依賴性的方式富集在心臟梗死區(qū)域，而SSMφ1細(xì)胞在心肌梗死后的所有時(shí)間點(diǎn)都分散在心臟中。

 

• 中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞亞群

中性粒細(xì)胞是MI后第一天內(nèi)最大的細(xì)胞群，接下來(lái)進(jìn)一步鑒定5個(gè)不同的中性粒細(xì)胞亞簇（圖4a），研究不同階段中性粒細(xì)胞和DC細(xì)胞占比及基因改變。結(jié)果顯示，MI前cluster 1和cluster 3占比高，而在MI后第1天cluster 3的比例明顯下降，在MI后第7天逐漸增加，MI后cluster 1沒(méi)有明顯變化的趨勢(shì)。相反，MI前cluster 2的占比較少，但在MI后第1天顯著增加，并在第3天達(dá)到峰值。cluster 4高表達(dá)與干擾素信號(hào)相關(guān)的基因，Hspa5、Dnajb9f和Hyou1等上調(diào)。對(duì)于DC細(xì)胞，鑒定出6個(gè)不同的亞簇，其中cluster 2、3和4在MI死前占比高，但在MI后第5天比例逐漸下降。cluster 4表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，高表達(dá)Xcr1和Clec9a；cluster 6中漿細(xì)胞樣DC標(biāo)記基因的上調(diào)。

 

• 心肌梗死后Trem2的表達(dá)

先前的研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展過(guò)程中，小鼠心臟中Trem2的表達(dá)增加。在本研究中，免疫組化顯示，MI后梗死區(qū)Trem2的表達(dá)逐漸增加。WB結(jié)果顯示，full-lengthTrem2的表達(dá)量逐漸增加，在MI后第5天達(dá)到峰值；而solubleTrem2 (sTrem2)在MI后第3天后增加，并在第7天達(dá)到峰值。接下來(lái)，通過(guò)共定位實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Trem2hi巨噬細(xì)胞是否是MI后Trem2表達(dá)模式的主要細(xì)胞群。結(jié)果顯示，Trem2信號(hào)與CD68+信號(hào)共定位（CD68+巨噬細(xì)胞在梗死區(qū)域明顯增加），說(shuō)明Trem2過(guò)表達(dá)主要發(fā)生在巨噬細(xì)胞中。此外，研究者還評(píng)估了MI后第3天和第5天，在 Trem2hi and Trem2low細(xì)胞中sTrem2的分泌水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sTrem2僅在Trem2hi巨噬細(xì)胞中分泌，并且sTrem2水平在MI第5天明顯高于第3天。這些結(jié)果表明Trem2在梗死心臟的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，而sTrem2只由Trem2hi巨噬細(xì)胞分泌。

 

• MI后期Trem2hi巨噬細(xì)胞在損傷心臟中發(fā)揮抗炎作用

接下來(lái)通過(guò)流式細(xì)胞數(shù)術(shù)分離心肌梗死小鼠模型中Trem2巨噬細(xì)胞的主要亞群進(jìn)行鑒定，包括MI早期和晚期的Ccr2hi和Trem2hi巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示，Ccr2hi巨噬細(xì)胞的比例在MI后第1天迅速增加，然后逐漸下降，說(shuō)明巨噬細(xì)胞被招募到梗死區(qū)域（與scRNA-seq數(shù)據(jù)分析一致）。Trem2hi巨噬細(xì)胞的比例在MI后第3天開(kāi)始增加，在第5天達(dá)到峰值，說(shuō)明Trem2h主要在MI晚期發(fā)揮功能。Ccr2hi和Trem2hi巨噬細(xì)胞亞群基因分析結(jié)果顯示Ccr2hi巨噬細(xì)胞促炎因子相關(guān)基因的表達(dá)更高，而Trem2hi巨噬細(xì)胞則表達(dá)更高水平的抗炎因子相關(guān)基因。以上結(jié)果表明，Trem2hi細(xì)胞可能具有抗炎巨噬細(xì)胞的特性。這些數(shù)據(jù)表明Trem2hi巨噬細(xì)胞在心肌梗死晚期占主導(dǎo)地位，并具有抗炎特性。

• 體內(nèi)注射可溶性soluble Trem2后左心室重構(gòu)明顯改善

為了驗(yàn)證sTrem2對(duì)心肌梗死后重構(gòu)的影響，研究者向MI小鼠注射sTrem2，與對(duì)照組MI小鼠比較。結(jié)果顯示，sTrem2組小鼠MI后28天左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)和收縮末期容積(ESV)顯著降低；左室擴(kuò)張和重構(gòu)良好，梗死壁更厚，纖維化更低；sTrem2組小鼠的梗死面積明顯小于對(duì)照組小鼠，存活率明顯增加�？傊�，這些結(jié)果表明，sTrem2在體內(nèi)促進(jìn)了梗死心臟的功能和結(jié)構(gòu)的改善。

 

主要結(jié)論

本研究探索巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的時(shí)空動(dòng)態(tài)及Trem2hi巨噬細(xì)胞在心臟組織修復(fù)中的潛在功能，繪制了MI后梗死心臟的一個(gè)全面的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組圖譜。對(duì)目前理解心肌梗死驅(qū)動(dòng)的免疫反應(yīng)做出了重要貢獻(xiàn)，并且對(duì)與Trem2信號(hào)通路調(diào)控因子的深入研究將有助于建立心肌梗死后心衰的新治療策略。

 

四. 參考文獻(xiàn)

Jung SH, Hwang BH, Shin S, et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2himacrophages in infarcted hearts. Nat Commun. 2022;13(1):4580. Published 2022 Aug 6.