2022年7月11日，浙江大學郭國驥/韓曉平教授團隊在國際權威期刊Nature Genetics (IF=41.3069) 上發(fā)表了題為“Systematic identification of cell-fate regulatory programs using a single-cell atlas of mouse development”的最新成果，研究從單細胞水平上構建了小鼠發(fā)育過程中譜系分化的細胞圖譜，結合4D蛋白質組學技術，描繪了小鼠譜系發(fā)育和成熟過程的細胞狀態(tài)流形圖，并揭示了控制細胞命運決定的基因調控網絡。

 

文章概述

該研究在單細胞水平構建了發(fā)育過程中小鼠譜系分化的細胞圖譜，并描述了細胞類型成熟過程中譜系共同和譜系特異性調節(jié)程序。還發(fā)現(xiàn)在無脊椎動物和脊椎動物的發(fā)育過程中廣泛活躍的譜系共同調節(jié)程序。特別是，確定了Xbp1是不同物種細胞命運決定的進化保守調節(jié)因子。證明了Xbp1轉錄調控對于穩(wěn)定多種小鼠細胞類型的基因調控網絡非常重要。該研究結果為細胞基因調控程序提供了遺傳和分子方面的見解，并將作為進一步推進細胞命運決策理解的基礎。

 

研究結果

• 小鼠細胞分化圖譜（MCDA）的構建

作者對小鼠從早期胚胎階段到成熟成年階段的七個生命階段進行了單細胞轉錄組學分析：胚胎期（E）10.5、E12.5、E14.5、出生后（P）0、P10、P21和成年。共分析了520000多個單細胞（圖1b）。包括分布在不同系統(tǒng)中的器官：大腦、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肺、胰腺、胃、睪丸和子宮。對每個組織相鄰階段的差異表達基因（DEG）的分析表明，不同階段的組織成熟臨界期不同。從P0和P10樣本中觀察到許多不同的亞群，表明出生后細胞繼續(xù)轉變。

圖1 小鼠分化的單細胞轉錄圖譜

 

• 小鼠發(fā)育過程中的細胞變化

以腎臟的動態(tài)變化為代表進行研究。分析從E10.5至成人階段的腎臟樣本，定義了30個具有典型標志物的聚類，其中包括基質細胞、腎單位上皮細胞、開窗內皮細胞和免疫細胞（圖2a）。值得注意的是，UB細胞和NPC包括P0期的細胞，而遠端和近端SSB細胞包括P10期的細胞（圖2b）。這一結果表明，小鼠的腎臟生成在出生后繼續(xù)，而不是在出生前完成。此外，腎功能的成熟持續(xù)到成年階段，并逐漸發(fā)生生理變化。

為了揭示發(fā)育過程中小鼠組織中的細胞異質性，對不同階段的每個組織進行了t-SNE和差異基因表達分析。發(fā)現(xiàn)了37個先前未被識別的細胞群體，它們具有與小鼠發(fā)育相關的有趣的基因表達模式。鑒定了在P0階段在腸和腦中共同表達肌細胞（Myl9，Acta2）和內皮細胞（Esam，Gng11）標記物的細胞（圖2c，d）。Myl9和Esam的共同免疫熒光進一步證實了scRNA-seq結果（圖2e，f）。

總之，具有共表達或異位表達模式的祖細胞池可能廣泛存在于發(fā)育中的器官中，這提示了哺乳動物在終末分化前的狀態(tài)多樣性的復雜性。

圖2 小鼠組織中的細胞異質性

 

• MCDA中調控機制的表征

為了識別細胞身份的關鍵轉錄因子（TFs），利用數(shù)據(jù)驅動（SCENIC）32和數(shù)據(jù)庫衍生（VIPER-DOROTHEA）方法來估計TF的活性�；�于單細胞數(shù)據(jù)集，檢測組織特異性TF的靈敏度達到>75%。確定了900多個TF，置信水平從A（高置信度）到C（低置信度）。結果表明，這些譜系共同TF在一系列小鼠細胞類型的成熟過程中起著重要的調節(jié)作用。

圖3 MCDa中調控機制的分析

 

• 跨物種細胞命運決定過程中的全局特征

了探索跨物種發(fā)育中的常見變化，進行了熵分析，發(fā)現(xiàn)所有七個物種的熵隨著發(fā)育而降低，這表明轉錄穩(wěn)定性的增加在進化上是保守的（圖4a-f）。發(fā)育過程中下調的基因富含核糖體蛋白質基因、線粒體核糖體蛋白基因和小核核糖核蛋白基因（圖4g）。值得注意的是，Myc和Mycn作為核糖體生物發(fā)生的調節(jié)劑，在小鼠發(fā)育的早期階段顯示出高活性分數(shù)（圖4h）。結果表明，核糖體蛋白質基因是干細胞的一個保守特征，在細胞類型分化過程中它們被下調。另一方面，上調基因在免疫途徑中高度富集，這與最近關于人和小鼠成體組織的報告一致。介紹了從無脊椎動物到脊椎動物的譜系發(fā)育過程中的一系列共同特征；特定的核糖體蛋白基因在分化程度較低的細胞中富集。

圖4 跨物種細胞分化的全局特征

 

• 跨物種細胞命運決定的基因調控網絡

對于不同物種間的譜系共同調節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)幾種常見上調的TF表現(xiàn)出顯著的收斂性，包括XBP1、JUND、FOSB、JUN、BHLHE40和其他（圖5a），與各種成年小鼠組織中的富集TF一致（圖3c）。這些TF還與人類細胞圖譜（HCL）中富含譜系特異性祖細胞（GATA1、PAX6、NKX6-2、NEUROD1、SOX10、OLIG2）的TF表現(xiàn)出強烈的負相關，HCL是由Microwell-seq14生成的人類綜合細胞圖譜（圖5b）。懷疑這些TF可能作為進化上保守的調節(jié)因子，引導多系細胞分化和成熟。作者發(fā)現(xiàn)，在所有七種物種中，只有一種TF Xbp1突出（圖5a）。作為一種假定的共同調節(jié)因子，Xbp1顯示了大多數(shù)MCDA譜系中的上調表達模式（圖5c）。從細胞圖譜的角度進一步剖析了其調節(jié)作用，并發(fā)現(xiàn)干細胞調節(jié)因子如SOX4、SON和HES1與HCL中的XBP1最負相關（圖5d）。此外，在使用小鼠和人類（圖5e，f）的測序（scATAC seq）數(shù)據(jù)進行的轉座酶可及染色質單細胞分析中，造血祖細胞和神經祖細胞中的XBP1結合基序的富集程度低于其相應的成熟細胞類型。

圖5 跨物種細胞命運決定過程中基因調控的推斷

 

• Xbp1作為多譜系進展中的常見調節(jié)因子

Xbp1的破壞導致小鼠胚胎獲得更多祖細胞狀態(tài)。了表征蛋白質水平的功能喪失變化，對WT和敲除（KO）胚胎進行了液相色譜-質譜（LC-MS）蛋白質組學分析。Xbp1−/−胚胎表現(xiàn)出更高表達水平的多能相關蛋白，如Lin28a、Lin28b、Pcgf6和Jarid2，以及更低表達水平的細胞類型特異性蛋白，如神經細胞中的Snca、基質細胞中的Clu、肝細胞中的Afp、巨噬細胞中的C1qb和紅系細胞中的Blvrb（圖6f）。

圖6 ScRNa序列和高分辨率質譜顯示Xbp1−/−胚胎中的基因和蛋白質變化

 

總結

研究從單細胞水平上構建了小鼠發(fā)育過程中譜系分化的細胞圖譜，結合4D蛋白質組學技術，描繪了小鼠譜系發(fā)育和成熟過程的細胞狀態(tài)流形圖，并揭示了控制細胞命運決定的基因調控網絡。

 

參考文獻：

Fei L, Chen H, Ma L, E W, Wang R, Fang X, Zhou Z, Sun H, Wang J, Jiang M, Wang X, Yu C, Mei Y, Jia D, Zhang T, Han X, Guo G. Systematic identification of cell-fate regulatory programs using a single-cell atlas of mouse development. Nat Genet. 2022 Jul;54(7):1051-1061. doi: 10.1038/s41588-022-01118-8. Epub 2022 Jul 11. Erratum in: Nat Genet. 2022 Aug 3;: PMID: 35817981.