貼壁細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解決方案
① 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞不貼壁
可能原因：胰蛋白酶消化過度；支原體污染；培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）；細(xì)胞老化；接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。
解決方法：縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物；使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2；
啟用新的保種細(xì)胞；調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。
② 懸浮細(xì)胞成簇
可能原因：培養(yǎng)液中含鈣,鎂離子；支原體污染；蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解；DNA污染。
解決方法：用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液；分離培養(yǎng)物，檢測支原體；DNasel處理細(xì)胞。
③ 培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢
可能原因：由于更換不同培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；接種細(xì)胞起始濃度太低；細(xì)胞已老化；支原體污染。
解決方法：比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；增加接種細(xì)胞起始濃度；換用新的保種細(xì)胞；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
④ 培養(yǎng)細(xì)胞生長不好
可能原因：
Ø 細(xì)胞本身的狀態(tài)
細(xì)胞傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化；
細(xì)胞的接種量：接種量過低，細(xì)胞生長緩慢；
細(xì)胞傳代時間過晚：細(xì)胞中毒，影響傳代后的細(xì)胞生長；
胰酶消化時間過長或過短：時間過長，細(xì)胞死亡；時間過短，細(xì)胞未完全分離而成團(tuán)，細(xì)胞死亡；
細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速溶。
Ø 污染
支原體污染；
霉菌污染。
Ø 培養(yǎng)基或血清
更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證；
選擇的培養(yǎng)基是否合適；
培養(yǎng)基配制是否合適；
培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤。
Ø 培養(yǎng)環(huán)境
CO2供應(yīng)是否正常；
培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。
解決方法：
根據(jù)以上四個方面的可能原因，做出針對性的解決方案
Ø 注意細(xì)胞的本身狀態(tài)：如傳代次數(shù)，接種量等：
Ø 避免產(chǎn)生污染（用正規(guī)，合法，可朔源的血清）；
Ø 要用合適的血清或培養(yǎng)基，最好經(jīng)過驗(yàn)證；
Ø 注意實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境。
⑤ 培養(yǎng)細(xì)胞死亡
可能原因：培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2；培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大；細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷；培養(yǎng)液滲透壓不正確；培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積。
解決方法：檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2；檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度；取新的保存細(xì)胞種；檢測培養(yǎng)液滲透壓；換入新鮮培養(yǎng)液。
可能原因：胰蛋白酶消化過度；支原體污染；培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）；細(xì)胞老化；接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。
解決方法：縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物；使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2；
啟用新的保種細(xì)胞；調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。
② 懸浮細(xì)胞成簇
可能原因：培養(yǎng)液中含鈣,鎂離子；支原體污染；蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解；DNA污染。
解決方法：用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液；分離培養(yǎng)物，檢測支原體；DNasel處理細(xì)胞。
③ 培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢
可能原因：由于更換不同培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；接種細(xì)胞起始濃度太低；細(xì)胞已老化；支原體污染。
解決方法：比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；增加接種細(xì)胞起始濃度；換用新的保種細(xì)胞；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
④ 培養(yǎng)細(xì)胞生長不好
可能原因：
Ø 細(xì)胞本身的狀態(tài)
細(xì)胞傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化；
細(xì)胞的接種量：接種量過低，細(xì)胞生長緩慢；
細(xì)胞傳代時間過晚：細(xì)胞中毒，影響傳代后的細(xì)胞生長；
胰酶消化時間過長或過短：時間過長，細(xì)胞死亡；時間過短，細(xì)胞未完全分離而成團(tuán)，細(xì)胞死亡；
細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速溶。
Ø 污染
支原體污染；
霉菌污染。
Ø 培養(yǎng)基或血清
更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證；
選擇的培養(yǎng)基是否合適；
培養(yǎng)基配制是否合適；
培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤。
Ø 培養(yǎng)環(huán)境
CO2供應(yīng)是否正常；
培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。
解決方法：
根據(jù)以上四個方面的可能原因，做出針對性的解決方案
Ø 注意細(xì)胞的本身狀態(tài)：如傳代次數(shù)，接種量等：
Ø 避免產(chǎn)生污染（用正規(guī)，合法，可朔源的血清）；
Ø 要用合適的血清或培養(yǎng)基，最好經(jīng)過驗(yàn)證；
Ø 注意實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境。
⑤ 培養(yǎng)細(xì)胞死亡
可能原因：培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2；培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大；細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷；培養(yǎng)液滲透壓不正確；培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積。
解決方法：檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2；檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度；取新的保存細(xì)胞種；檢測培養(yǎng)液滲透壓；換入新鮮培養(yǎng)液。
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