圖1. 正常乳腺上皮細(xì)胞的乳腺圖譜和scRNA-seq分析工作流程

2. 闡明正常乳房微環(huán)境和伴隨激素狀態(tài)的變化
通過(guò)分析從絕經(jīng)前(n = 8)和絕經(jīng)后(n = 5)女性減容乳房成形術(shù)中分離出來(lái)的總組織細(xì)胞，研究了正常乳腺組織的免疫和基質(zhì)微環(huán)境。經(jīng)過(guò)質(zhì)量篩選后，scRNA-seq分析得到54,332個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜。單細(xì)胞表達(dá)譜的整合和聚類產(chǎn)生了8個(gè)主要的cluster。EPCAM表達(dá)顯示其中3個(gè)cluster為上皮細(xì)胞。為了進(jìn)一步探究導(dǎo)管微環(huán)境中細(xì)胞的身份，將EPCAM+上皮細(xì)胞移除，剩余細(xì)胞重新聚集，從而產(chǎn)生7個(gè)非上皮細(xì)胞的cluster。偽體樣本的差異表達(dá)分析為每個(gè)cluster選擇了標(biāo)記基因，確定了細(xì)胞類型。與人類乳房的纖維和血管性質(zhì)一致，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞構(gòu)成了主要部分。絕經(jīng)前和絕經(jīng)后組織微環(huán)境中的組織常駐細(xì)胞表現(xiàn)出一些差異。在絕經(jīng)后組織中，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的比例分別較低和較高。盡管患者間存在差異，但絕經(jīng)前和絕經(jīng)后微環(huán)境之間的細(xì)胞類型組成差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
 

圖2. 絕經(jīng)后乳腺組織微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄變化

3. 絕經(jīng)后乳腺組織中上皮相關(guān)成纖維細(xì)胞的變化
除某些髓系marker外，大多數(shù)免疫亞群的幾個(gè)決定性細(xì)胞標(biāo)記物在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后組織之間的表達(dá)相似。在成纖維細(xì)胞中，基質(zhì)相關(guān)基因的細(xì)胞比例較低。乳腺組織的高分辨率共聚焦成像顯示，絕經(jīng)后組織中PDGFRb+成纖維細(xì)胞的表達(dá)和空間分布顯著減少。將絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女的細(xì)胞重新聚類，在這5個(gè)cluster中，有3個(gè)cluster在所有激素環(huán)境下的標(biāo)本中都是常見(jiàn)的。KEGG通路分析顯示cluster1富含免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路。頂部標(biāo)記基因表達(dá)分析顯示，cluster 1中基質(zhì)金屬蛋白酶和趨化因子表達(dá)豐富。cluster2的特征是與立即早期反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和DNA損傷基因的表達(dá)相關(guān)。
 

圖2. 絕經(jīng)后乳腺組織微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄變化

4. BRCA1突變攜帶者癌前組織分析
對(duì)4名BRCA1突變攜帶者的預(yù)防性乳房切除術(shù)(病理正常)中獲得組織進(jìn)行scRNA-seq分析，與圖2A中的8個(gè)正常(WT)絕經(jīng)前合并分析，生成了包含59,766個(gè)乳腺細(xì)胞的聯(lián)合t-SNE圖。正常組織和癌前組織中不同簇的比例相似(P = 0.14)。對(duì)4例BRCA1突變TNBC腫瘤患者，與先前確定的瘤前病變譜進(jìn)行整合，聚類發(fā)現(xiàn)13個(gè)cluster。
 

圖4. 正常組織、BRCA1+/-癌前組織和BRCA1相關(guān)腫瘤的scRNA-seq比較

5. BRCA1+/-癌前組織與腫瘤的微環(huán)境改變
去除正常和腫瘤上皮細(xì)胞后，微環(huán)境中的細(xì)胞重新聚類，產(chǎn)生9個(gè)cluster。腫瘤與癌前組織的微環(huán)境有明顯的實(shí)質(zhì)性變化，兩組患者的cluster分布不均勻�；�質(zhì)細(xì)胞和血管細(xì)胞所占比例較小，這可能反映了腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。個(gè)體患者之間的cluster比例有相當(dāng)大的差異。在BRCA1相關(guān)腫瘤中明顯存在大量TIL人群。Treg細(xì)胞在腫瘤中顯著，而在癌前組織中檢測(cè)不到。在不同患者樣本的基質(zhì)和免疫組成中觀察到的巨大差異不僅反映了固有的組織多樣性，還反映了其他參數(shù)，包括病理標(biāo)本在整個(gè)腫瘤/組織中的位置，組織收集和處理之間的時(shí)間，以及用于分離不同細(xì)胞類型的精確消化方案。
 

圖5. BRCA1+/-癌前組織與腫瘤的微環(huán)境改變

6. 乳腺癌主要亞型之間的腫瘤異質(zhì)性
CNV分析用于區(qū)分正常和惡性上皮細(xì)胞，在HER2+和ER+標(biāo)本中檢測(cè)到正常上皮cluster。每個(gè)腫瘤亞型都包含兩個(gè)突出的EPCAM+。所有亞型都包含一個(gè)離散的循環(huán)MKI67+腫瘤細(xì)胞簇，但這在TNBC中最為普遍。TNBC中的MKI67+亞群在ESR1和PGR中呈陰性，而在HER2+腫瘤中，兩個(gè)cluster都表達(dá)ERBB2+和ESR1。ER+腫瘤的KEGG通路分析顯示，cluster1中雌激素和類固醇信號(hào)通路富集，cluster2中DNA復(fù)制和修復(fù)通路富集。
 

圖6. 乳腺癌主要亞型之間的腫瘤異質(zhì)性

7. 不同乳腺腫瘤亞型微環(huán)境的反卷積
微環(huán)境中的主要的cluster是根據(jù)譜系特異性基因的表達(dá)來(lái)確定的。偽體樣本的熱圖顯示了每個(gè)cluster的marker基因。通過(guò)偽體讀計(jì)數(shù)的差異表達(dá)分析，確定每個(gè)cluster的前30個(gè)marker基因。
 

圖7. 不同乳腺腫瘤亞型微環(huán)境的反卷積

8. 分析原發(fā)腫瘤和浸潤(rùn)淋巴結(jié)的scRNA-seq，可以確定腫瘤細(xì)胞的克隆繁殖
結(jié)合7例ER+患者匹配的腫瘤和淋巴結(jié)樣本的t-SNE圖。顯示了根據(jù)原發(fā)腫瘤或受累淋巴結(jié)細(xì)胞(黃色)標(biāo)記的合并細(xì)胞。繪制每條染色體的拷貝數(shù)變異(CNV)。通過(guò)CNV豐度可以將腫瘤細(xì)胞與正常(N)細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。
 

圖8. 分析原發(fā)腫瘤和浸潤(rùn)淋巴結(jié)的scRNA-seq，可以確定腫瘤細(xì)胞的克隆繁殖

參考文獻(xiàn)：
Pal B, Chen Y, Vaillant F, Capaldo BD, Joyce R, Song X, Bryant VL, Penington JS, Di Stefano L, Tubau Ribera N, Wilcox S, Mann GB; kConFab; Papenfuss AT, Lindeman GJ, Smyth GK, Visvader JE. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast. EMBO J. 2021 Jun 1;40(11):e107333. doi: 10.15252/embj.2020pub 2021 May 5. PMID: 33950524; PMCID: PMC8167363.