在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，包括但不限于巨噬細胞、DC（dendritic cell）、中性粒細胞、B細胞、T細胞、CAF（tumor associated fibroblast）等多種細胞被招募到腫瘤細胞周圍的微環(huán)境中，與ECM（extracellular matrix）等元素共同構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境TIME（tumor immune microenvironment）。

在TIME中的多種成分，包括T細胞、B細胞以及分泌的相關(guān)因子等雖然對腫瘤起著免疫作用，但還有許多其它成分，如細胞方面包括M2型巨噬細胞、Treg細胞、Th2細胞及MDSC （Myeloid‑derived suppressor cell）等發(fā)揮著免疫抑制的作用，細胞因子方面IL-4、IL-5、IL-10、TGFβ、MMP9和VEGF等等也通過特定的機制起著促進免疫逃逸和腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。在免疫的過程中，腫瘤細胞也衍生出了各種對抗免疫的機制，例減少抗原的表達，抑制DC細胞的抗原遞呈能力，抑制細胞毒性T細胞的浸潤等等。

在過去的十年里，雖然關(guān)于TIME的研究文章呈逐年遞增的狀態(tài)，TIME方向作為國自然研究的熱點，提供了大量的基金支持，但鑒于TIME的復(fù)雜性以及癌癥治療的困難性、高復(fù)發(fā)率，對TIME的研究仍任重道遠。在這里，小優(yōu)博士又整理了兩篇近期發(fā)表的關(guān)于TIME的高分文章，分別從研究背景、主要研究結(jié)果方面分享給大家，并對相關(guān)的研究思路做了部分總結(jié)，希望對大家的科學(xué)研究起到幫助作用。

一、單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示癌癥相關(guān)成纖維細胞在復(fù)發(fā)性骨肉瘤腫瘤免疫微環(huán)境中的調(diào)節(jié)作用
 

研究背景：
骨肉瘤是最常見的骨腫瘤之一，主要發(fā)生在青少年。盡管在手術(shù)和化療方面取得了很大的成就，但骨肉瘤患者的預(yù)后仍不理想。復(fù)發(fā)性骨肉瘤是臨床的一大挑戰(zhàn)，復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者預(yù)后較差。因此，迫切需要深入探討骨肉瘤的進展機制，加強對復(fù)發(fā)性骨肉瘤的認識。

腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment, TME)主要由多種細胞類型和細胞外基質(zhì)組成，與癌細胞相互作用，促進癌癥進展。癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAFs)是TME中最常見的細胞，可通過癌癥干細胞更新、免疫治療療效減弱和化療耐藥性導(dǎo)致癌癥進展。然而，CAFs免疫抑制特征在OS中的作用和機制值得進一步研究。

單細胞RNA測序(scRNA-seq)是一種強大的新工具，可以檢測遺傳和功能異質(zhì)性，重建細胞成分及其相互作用，并檢測罕見的TME亞群。ScRNA-seq用于識別和分析OS的精確細胞簇和組成。然而，這些研究都集中在細胞成分上，并沒有明確闡明TME在OS進展中的作用和機制。

本研究在前期研究GSE152048和GSE162454的基礎(chǔ)上，利用scRNA-seq和生物信息學(xué)技術(shù)揭示CAFs在復(fù)發(fā)性O(shè)S TME中的調(diào)控作用。這可能在單細胞水平上促進對CAFs在復(fù)發(fā)性骨肉瘤TME中的作用和機制的理解，為骨肉瘤的治療提供新的靶點。

首先，為了便于大家理解本文的研究思路，作者精心制作了一個研究流程圖，如下：根據(jù)GSE152048 (BC)和GSE162454 (OS)的數(shù)據(jù)集，作者進行了scRNA-seq分析，以研究原發(fā)性、復(fù)發(fā)性和肺轉(zhuǎn)移性骨肉瘤病變的細胞構(gòu)成。GSE152048 (BC)包括來自7個原發(fā)、2個復(fù)發(fā)和2個肺轉(zhuǎn)移性O(shè)S病變的100987個細胞。GSE162454 (OS)包括29278個細胞，這些細胞來自6個原發(fā)性O(shè)S患者在接受新輔助化療之前。此外，作者又使用三個配對的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性O(shè)S樣本，通過免疫熒光、預(yù)后分析等方法來驗證scRNA-seq的結(jié)果。
 

文章研究路線圖

主要結(jié)果部分：
1 復(fù)發(fā)性O(shè)S中，CAFs的浸潤水平較高
經(jīng)過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性、復(fù)發(fā)性和肺轉(zhuǎn)移性O(shè)S病灶中鑒定出14種細胞類型（A），且三種OS病灶的t-SNE圖疊加，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性O(shè)S病變的Div-CAFs（diverse CAF）較突出(B)。雖然細胞種類在三種類型的OS病灶中沒有大的差異，但部分比例變化非常大，尤其是腫瘤相關(guān)成纖維細胞CAF，原發(fā)性與復(fù)發(fā)性的比例為3.58%和96.42% (C)，說明了復(fù)發(fā)性O(shè)S中，CAFs的浸潤水平比較高。
 

2 在復(fù)發(fā)性O(shè)S患者組織中，CAFs與EMT相關(guān)
對原發(fā)性和復(fù)發(fā)性O(shè)S病灶中對差異表達的HALLMARK基因進行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)EMT（上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）通路相關(guān)基因在復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中明顯激活。
 

3 遺傳學(xué)方面證明CAFs在復(fù)發(fā)性O(shè)S中具有較高的浸潤性
（a）    WB檢測發(fā)現(xiàn)與OS細胞相比，CAFs具有較高的N-cadherin ( EMT 的marker )表達和較低的E-cadherin表達。同樣在復(fù)發(fā)性O(shè)S中，由于CAFs的浸潤較多，N-cadherin表達也較高(A)。
（b）    CAFs激活marker：(a-SMA：recombinant stromal cell derived factor 1，F(xiàn)AP: fibroblast activation protein) a-SMA和FAP在復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中顯著升高(B)。
（c）    通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析，F(xiàn)AP與EMT 的marker E-cadherin顯著負相關(guān)，而與N-cadherin顯著正相關(guān)(C)。
（d）    IF實驗補充表明復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中的a-SMA表達高于原發(fā)骨肉瘤組織，E-cadherin表達較低(D)。
 

4 CAFs表達的LOX的表達模式及臨床意義
LOX: lysyl oxidase,賴氨酸氧化酶，是細胞外基質(zhì)中分泌的一種酶，底物是膠原蛋白和彈性蛋白（骨和肺的主要成分），這也是為什么骨肉瘤容易向肺部轉(zhuǎn)移的一個主要原因。

通過對CAFs和Div-CAFs細胞中差異表達的基因數(shù)據(jù)分析(A, B)及IHC實驗(C, D)驗證表明LOX在復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中較原發(fā)性高，預(yù)后分析也表明LOX的高表達導(dǎo)致明顯的預(yù)后較差(E)。
 

 
5 在體外LOX 促進復(fù)發(fā)性O(shè)S
接下來，作者用LOX的抑制劑BAPN (β-氨基丙腈是一種特異性的不可逆LOX抑制劑，作用于LOX或LOXL同工酶的活性位點)進行處理，發(fā)現(xiàn)：CAF細胞降低，OS及TAM細胞無明顯變化（A）；CAF的基質(zhì)激活marker a-SMA和FAP表達量降低（B）；N-cadherin ( EMT 通路的marker )表達降低（C, D）；OS 細胞的遷移率及傷口愈合速率均明顯降低篇（E）；另外檢測到起促進免疫反應(yīng)的M1類型的巨噬細胞（INOS）明顯升高而抑制免疫反應(yīng)的M2型巨噬細胞（CD163）降低（F）。
 

6 在體內(nèi)，LOX抑制產(chǎn)生抗OS作用
接下來在體內(nèi)驗證LOX的作用，對腫瘤進行異種移植，經(jīng)BAPN處理后，檢測到腫瘤體積降低， LOX表達水平降低（A，B）；CAF的基質(zhì)激活marker a-SMA和FAP表達量也降低（C）；同樣的與體外檢測結(jié)果一致，M1類型的巨噬細胞明顯升高而M2型巨噬細胞降低（D）；最后，CD8細胞有所升高但不明顯（E）。
 

最后，作者制作了一張示意圖，對本文的研究做出總結(jié)。即在復(fù)發(fā)性骨肉瘤中，CAFs浸潤水平較高，在復(fù)發(fā)性O(shè)S的細胞類型中，LOX在CAFs中表達量最高，BAPN抑制LOX可調(diào)節(jié)CAFs功能，誘導(dǎo)巨噬細胞向促進免疫的M1類型極化，進而抑制OS。
 

二、MUC1-C在三陰性乳腺癌中整合IFN-γ通路的激活和腫瘤免疫微環(huán)境的抑制
 
Doi:10.1136/jitc-2020-002115

研究背景：
三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性疾病，治療選擇有限。TNBC患者通常采用新輔助或輔助化療。TNBC患者對化療反應(yīng)的生存期改善與腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的存在有關(guān)。因此，腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)中TILs (特別是CD8+ T細胞)的增加可以預(yù)測早期TNBC患者對治療的反應(yīng)和預(yù)后的改善。

MUC1-C是一種在TNBC細胞中異常表達的致癌蛋白。MUC1-C通過誘導(dǎo)上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、表觀遺傳重編程、干性、自我更新能力來驅(qū)動TNBC細胞進展中的譜系可塑性。EMT和癌癥干細胞狀態(tài)與免疫逃避有關(guān)，盡管機制尚不清楚。

本文對大量和單個TNBC細胞RNA-seq數(shù)據(jù)集的分析進一步表明，MUC1與JAK1、STAT1、IRF1、IDO1和PTGES的內(nèi)在表達有關(guān)。在TNBC的腫瘤免疫微環(huán)境中，MUC1與CD8+ T細胞的衰竭和功能障礙有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為MUC1-C在TNBC中整合譜系可塑性和免疫抑制提供了新的見解。

主要結(jié)果部分：
1 MUC1-C激活I(lǐng)FN-γ→JAK1→STAT1信號通路富集的整個轉(zhuǎn)錄程序
對BT-549 TNBC細胞的整體轉(zhuǎn)錄譜分析表明，誘導(dǎo)MUC1-C沉默可導(dǎo)致基因表達的廣泛變化，約有2300個基因的表達產(chǎn)生了下調(diào)，1100多個基因的表達有所上調(diào)（A）。進一步分析發(fā)現(xiàn)沉默MUC1-C會導(dǎo)致(1)STAT1和IRF1（B）以及(2) IFN通路反應(yīng)基因的下調(diào)（C），與MUC1-C誘導(dǎo)的表達模式相關(guān)的主要調(diào)控因子包括STAT1和IRF1，證實MUC1-C通過STAT-IRF轉(zhuǎn)錄因子活性介導(dǎo)信號傳導(dǎo)(D)。Motif評估進一步驗證了MUC1-C誘導(dǎo)的差異表達基因在STAT和IRF Motif中高度富集(E)�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)表明STAT-IRF因子是MUC1-C誘導(dǎo)的TNBC細胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的主要驅(qū)動因素。

 

2 在TNBC細胞中MUC1-C激活JAK1→STAT1→IRF1信號
接下來，在BT-549和SUM149細胞中降低MUC1-C基因的表達，發(fā)現(xiàn)STAT1和IRF1基因在mRNA及蛋白水平的表達均有所降低（A-C）。通過對MUC1-C基因的蛋白序列分析，發(fā)現(xiàn)MUC1-C包含分別結(jié)合JAK1和IRF1的兩個motif，JAK1作為激酶，當MUC1-C結(jié)合兩種蛋白時，便會對STAT1進行磷酸化，因此在前面的實驗結(jié)果中，由于MUC1-C基因的下調(diào)，磷酸化的pSTAT1蛋白也降低（A-C）。接下來，通過用MUC1-C的抑制劑GO-203抑制MUC1-C的表達，同樣檢測到了JAK1，STAT1，pSTAT1, 及IRF1蛋白表達的下調(diào)，再次驗證了之前的結(jié)果。
 

3 下調(diào)MUC1-C 抑制IRF1下游基因 IDO1 和 COX2/PTGES
MUC1-C下調(diào)后，作者又對下游基因IDO1在BT-549及COX2/PTGES的表達情況進行了檢測。檢測到在BT-549、SUM149細胞中及抑制劑GO-203處理后，IDO1表達水平均降低（B-D）。 此外，作者發(fā)現(xiàn)MUC1-C驅(qū)動COX2/PTGS2和PTGES (E)的表達，它們共同合成PGE2 (一種與TNBC腫瘤生存率降低相關(guān)的T-cell功能抑制劑)。為了支持這些結(jié)果，對MDA-MB-468 TNBC細胞的研究證實MUC1-C驅(qū)動COX2和PTGES的表達(F-G)。

 

4 MUC1 與免疫細胞浸潤的減少有關(guān)
接下來，為了檢測MUC1-C對免疫細胞浸潤的影響，作者對兩種RNA-seq數(shù)據(jù)TCGA-BRCA cohort（A）及METABRIC cohort (B)進行了分析，結(jié)果顯示，相對于MUC1-C表達低的腫瘤，MUC1-C表達高的腫瘤中的免疫細胞浸潤明顯減少，特別是CD8 + T細胞、CD8 + naive T細胞、B細胞和Th2細胞等（C, D）。在MUC1-C表達低和MUC1-C表達高的情況下，細胞類型富集的總體模式在TCGA-BRCA和METABRIC隊列中顯著相關(guān)（E, F）。此外，在兩個數(shù)據(jù)中，基于所有免疫細胞類型估計的總免疫活性的定量在MUC1-C表達高的情況下顯著降低（G）。
 

5 MUC1-C在TNBC腫瘤中的表達與IFN-γ通路的激活和CD8+ T細胞的衰竭和功能紊亂有關(guān)
結(jié)合實驗結(jié)果及通過對TNBC腫瘤中TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)MUC1與IFN-γ通路的激活有關(guān)（A, B）；MUC1-C的表達與CD8+ naive T細胞的耗竭顯著相關(guān)（C, D）；IFN-γ通路在t細胞功能紊亂的TNBCs中高度富集（E, F）；此外還發(fā)現(xiàn)MUC1-C在兩種TNBC數(shù)據(jù)集中都與T-cell功能障礙顯著相關(guān)，這表明MUC1-C誘導(dǎo)的IFN-γ通路激活導(dǎo)致CD8+ T細胞排斥和功能障礙。

最后，對本文的研究做出總結(jié)，MUC1-C通過誘導(dǎo)IDO1和COX2激活I(lǐng)FN-γ→STAT1→IRF1通路（I），這為MUC1-C在TNBC的腫瘤免疫微環(huán)境中驅(qū)動CD8+ T細胞排斥和/或功能紊亂的潛在重要性提供了支持。
 

總結(jié)，在看了一些關(guān)于腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)的文章后，對于一些研究思路，小尤博士做了一些總結(jié)，并形成了一個流程圖，當然不能代表所有相關(guān)的思路，希望為各位小伙伴的研究帶來一些參考作用。