疫苗是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最偉大的進(jìn)步之一，也是一種重要的疾病防治手段，在傳染病防控中發(fā)揮著重要作用。自1798年天花疫苗和1885年狂犬病疫苗以來(lái)，疫苗技術(shù)從使用滅活及減毒病原體發(fā)展到使用僅包含可觸發(fā)免疫反應(yīng)的病原體成分的亞單位。常用的疫苗包括類病毒顆粒疫苗、重組病毒載體疫苗以及類毒素疫苗、多糖疫苗或蛋白疫苗。
 

 

傳統(tǒng)的減毒和滅活疫苗至今仍被廣泛使用（如卡介苗和脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗等）。然而，由于使用全部病原體，它們存在較大的安全性風(fēng)險(xiǎn)，通常它們沒(méi)有明確的成分。就類毒素疫苗和亞單位疫苗而言，盡管它們具有較好的安全性和穩(wěn)定性，但需要使用佐劑才能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，并且保護(hù)時(shí)間有限（表1）。因?yàn)闆](méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)工藝，傳統(tǒng)上的疫苗研發(fā)通常是一個(gè)漫長(zhǎng)、有挑戰(zhàn)性大且昂貴的過(guò)程。此外，SARS和埃博拉疫情以及新冠大流行表明，傳統(tǒng)的技術(shù)平臺(tái)并不適合快速、高效應(yīng)對(duì)突發(fā)公共安全事件。病毒載體和DNA技術(shù)是兩個(gè)前沿技術(shù)平臺(tái)，具有開(kāi)發(fā)快和生產(chǎn)工藝靈活性的特點(diǎn)。然而，病毒載體疫苗的生產(chǎn)成本高昂、成分復(fù)雜、保護(hù)率偏低且具有潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)，DNA疫苗的免疫原性差且存在基因整合安全性風(fēng)險(xiǎn)（表1），限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。

表1 各類疫苗的優(yōu)點(diǎn)（＋）和缺點(diǎn)（×）

 

mRNA一些獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，使其非常有希望成為傳統(tǒng)疫苗甚至DNA疫苗的替代品。與減毒或滅活疫苗不同，mRNA只表達(dá)特定抗原并定向誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。此外，它促進(jìn)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)先天免疫系統(tǒng)。與DNA疫苗相比，mRNA更安全有效，因?yàn)楸磉_(dá)不需要進(jìn)入細(xì)胞核，隨機(jī)基因組整合的概率幾乎為零；此外，mRNA在細(xì)胞中會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)（2-3天）降解。mRNA疫苗編碼不同抗原不會(huì)影響mRNA主體結(jié)構(gòu)的理化學(xué)性質(zhì)，有利于采用標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。由于mRNA生產(chǎn)是基于體外無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)，因此無(wú)其他疫苗生產(chǎn)中常見(jiàn)的細(xì)胞來(lái)源雜質(zhì)和病毒污染物等安全性風(fēng)險(xiǎn)。另外，mRNA疫苗開(kāi)發(fā)周期短且具有廣譜性，自2020年1月中國(guó)科學(xué)家公布新冠病毒基因序列，到12月FDA批準(zhǔn)BioNTech的BNT162b2的緊急使用權(quán)，僅僅間隔不到1年的時(shí)間。目前，mRNA疫苗正被研發(fā)用于多種傳染性疾病，例如HIV、狂犬病毒、流感、埃博拉、瘧原蟲(chóng)和呼吸道合包病毒（RSV）等。

 

▉mRNA疫苗結(jié)構(gòu)及工程化修飾

mRNA疫苗的結(jié)構(gòu)類似于真核mRNA，一個(gè)單鏈分子在5“端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)（Cap），在3“端有一個(gè)Poly（A）尾，一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）兩側(cè)有一個(gè)非翻譯區(qū)（UTR）。

圖2 mRNA疫苗結(jié)構(gòu)

 

5“Cap是mRNA疫苗非常重要的結(jié)構(gòu)，它與真核生物翻譯起始因子（eIF4E）結(jié)合來(lái)啟動(dòng)翻譯，另外5“Cap使其免于核酸外切酶的降解，還可促使mRNA環(huán)化形成空間及結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)穩(wěn)定性。甲基化程度不同可形成3種類型的帽子：CAP 0型、Cap 1型和Cap 2型。3’UTR尾部是一段Poly A序列，與帽子結(jié)構(gòu)類似，Poly（A）尾也能起到保護(hù)mRNA防止被核酸外切酶降解的作用，Poly A也參與到翻譯及其調(diào)控過(guò)程中，可與多聚腺苷酸結(jié)合蛋白（PABP）結(jié)合形成環(huán)狀復(fù)合物，參與翻譯的起始過(guò)程。非翻譯區(qū)（UTR）影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控和mRNA穩(wěn)定性，這些區(qū)域強(qiáng)烈影響翻譯效率。調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)的策略，如引入非天然核苷（NTPs），以及通過(guò)密碼子優(yōu)化提高翻譯效率，也常用于mRNA疫苗。輝瑞/BioNTech的mRNA疫苗BNT162b2和Moderna的mRNA-1273利用了核苷修飾技術(shù)，用假尿苷替換尿苷。而CureVac的mRNA疫苗CVnCoV使用未經(jīng)修飾的天然mRNA，通過(guò)其RNActive 平臺(tái)改變mRNA序列并優(yōu)化密碼子，以提高mRNA的穩(wěn)定性和免疫原性。

 

5“Cap、Poly A尾巴及編碼序列兩側(cè)的5ʹ和3ʹUTR元件深刻影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，這些都是疫苗的關(guān)鍵問(wèn)題。通過(guò)工程化改造mRNA疫苗可大大增加其穩(wěn)定性及免疫效力。

圖3 疫苗工程化修飾改造

 

▉mRNA生產(chǎn)及展望

與傳統(tǒng)疫苗相比，mRNA最重要的優(yōu)勢(shì)之一是其相對(duì)簡(jiǎn)單的制造。mRNA疫苗生產(chǎn)可分為上游加工（包括酶促反應(yīng)生成初級(jí)mRNA）和下游加工（包括純化mRNA）（圖4）。

圖4 mRNA生產(chǎn)工藝

 

▉上游工藝

轉(zhuǎn)錄：上游主要是以質(zhì)粒為模板在T7、SP6或T3 RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄成初級(jí)mRNA，該反應(yīng)只需要幾個(gè)小時(shí)，通常，每毫升反應(yīng)可獲得毫克級(jí)的初始mRNA。

 

加帽：初始mRNA加帽，可以在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間通過(guò)使用Cap類似物替代三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）底物來(lái)實(shí)現(xiàn)�；蛘�，可以使用牛痘加帽酶（VCC）和甲基供體作為底物在第二次酶反應(yīng)來(lái)加帽（圖4）。相比使用Cap類似物加帽（60–80%），盡管第二種方法的加帽效率更高（可達(dá)100%），但使用cap類似物加帽工藝更快，不需要二步酶促反應(yīng)。然而，由于價(jià)格的原因，Cap類似物可能會(huì)對(duì)生產(chǎn)成本產(chǎn)生影響，特別是在大規(guī)模制造的情況下考慮。

 

▉下游工藝

上游產(chǎn)生的mRNA需通過(guò)多個(gè)純化步驟從反應(yīng)混合物中分離和純化，以達(dá)到臨床質(zhì)量要求（圖4）。反應(yīng)混合物不僅包含所需mRNA，還包含許多雜質(zhì)，如酶、殘余NTP和DNA模板，以及轉(zhuǎn)錄期間形成的異常mRNA（如ds mRNA）。

 

色譜是制藥行業(yè)廣泛使用的一種純化方法，離子交換色譜法（IEC）可用于大規(guī)模純化mRNA，弱陰離子交換色譜法已成功用于mRNA的純化。然而，這種色譜必須在變性條件下進(jìn)行，使得該工藝需嚴(yán)格控制溫度。

 

Olig dT親和色譜可與mRNA中存在的poly-A尾部結(jié)合，常用于捕獲mRNA并獲得高純度產(chǎn)品，且可規(guī)模化純化生產(chǎn)，但存在結(jié)合能力低和低成效的缺點(diǎn)。

 

切向流過(guò)濾（TFF）濃縮可以去除小分子雜質(zhì)，這依賴于DNA酶消化去除質(zhì)粒模板，質(zhì)粒模板去除也可以通過(guò)羥基磷灰石法或疏水色譜法（HIC）實(shí)現(xiàn)。

 

▉未來(lái)方向

目前生產(chǎn)工藝（如體外轉(zhuǎn)錄工藝）難以滿足未來(lái)大規(guī)模商業(yè)化需求，連續(xù)流生產(chǎn)模式是未來(lái)的發(fā)展方向，具有低成本的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。連續(xù)流生產(chǎn)模式已經(jīng)在化學(xué)和制藥行業(yè)中使用，具有靈活且經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)。此外，連續(xù)流生產(chǎn)模式實(shí)現(xiàn)工藝的集成化還可以縮短生產(chǎn)時(shí)間，促進(jìn)自動(dòng)化和過(guò)程分析技術(shù)（PAT），從而提高生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。mRNA制造工藝的相對(duì)簡(jiǎn)單性使得該過(guò)程非常適合于連續(xù)流生產(chǎn)模式，尤其是在微流控模式下（圖5）。在這種規(guī)模下，在特定條件下可以加快反應(yīng)速度，可以最大限度地降低昂貴試劑（如牛痘加帽酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等）的成本。此外，即時(shí)基質(zhì)進(jìn)料和產(chǎn)品收獲策略可以在流程中實(shí)施，以促進(jìn)過(guò)程控制、再循環(huán)和物料的再利用。

圖5 mRNA連續(xù)流生產(chǎn)模式

 

▉mRNA商業(yè)化生產(chǎn)挑戰(zhàn)

在mRNA生產(chǎn)過(guò)程中作為起始模板使用的質(zhì)粒產(chǎn)能及質(zhì)量的非常關(guān)鍵因素，也是制約mRNA疫苗生產(chǎn)的瓶頸。mRNA生產(chǎn)需要以質(zhì)粒DNA為模板轉(zhuǎn)錄成初始mRNA，環(huán)狀質(zhì)粒需酶切線性化，線性化效率對(duì)工藝生產(chǎn)有較大影響；另外，質(zhì)粒模板中的Olig dT的長(zhǎng)度決定mRNA疫苗Poly A的長(zhǎng)度，Poly A長(zhǎng)度影響mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率，因而影響mRNA疫苗的有效性。另外，mRNA疫苗需要控制Poly A長(zhǎng)度及體外翻譯效率在一定范圍，Poly A長(zhǎng)度的分析方法及體外翻譯效率檢測(cè)方法也是mRNA疫苗質(zhì)量研究的難點(diǎn)，非常具有挑戰(zhàn)性。Poly A長(zhǎng)度及外翻譯效率取決于質(zhì)粒模板中的Olig dT的長(zhǎng)度，質(zhì)粒模板中的Olig dT常隨大腸桿菌傳代而丟失，因此在源頭上控制質(zhì)粒模板的質(zhì)量對(duì)mRNA疫苗的效果非常重要。

 

質(zhì)粒作為mRNA生產(chǎn)的關(guān)鍵原材料，需要在良好生產(chǎn)規(guī)范（cGMP）條件下，且需要有穩(wěn)健的工藝，在臨床試驗(yàn)審批（Investigational New Drug，簡(jiǎn)稱IND）申報(bào)時(shí)需要提供藥學(xué)研究資料，包括主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)、質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝等，在制備用于產(chǎn)生質(zhì)粒DNA的工程菌庫(kù)時(shí)，也需遵循cGMP實(shí)踐的原則并參照指南進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

 

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