利用轉(zhuǎn)錄+蛋白聯(lián)合解析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移藥物

瀏覽次數(shù)：1461　發(fā)布日期：2022-9-21　來(lái)源：中科新生命

結(jié)直腸癌 (Colorectal cancer, CRC) 在惡性腫瘤中發(fā)病率排第三，死亡率占據(jù)第二位，并且CRC肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）的死亡率超過(guò)70%。目前常用于治療CRCLM的藥物是血管生成抑制劑貝伐單抗，然而，經(jīng)常出現(xiàn)先天性或獲得性耐藥導(dǎo)致治療失敗和癌癥復(fù)發(fā)。已有研究證明CRCLM能夠通過(guò)血管劫持（vessel co-option）過(guò)程產(chǎn)生耐藥，血管劫持過(guò)程指的是隨著時(shí)間的推移，腫瘤可學(xué)會(huì)“劫持”周圍組織的正常血管對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，不過(guò)針對(duì)血管劫持機(jī)制的研究主要集中“劫持者”腫瘤細(xì)胞方向，而“被劫持者”竇狀毛細(xì)血管方向的作用機(jī)制還尚未探索。組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用為復(fù)雜疾病的機(jī)制探究提供了便利，技術(shù)的革新更是將人類健康和疾病的研究推上了新的臺(tái)階。

2022年8月，來(lái)自暨南大學(xué)陳敏鋒、葉文才及張冬梅共同通訊在Journal of Clinical Investigation （IF=19）在線發(fā)表題為《Targeting FAPα-expressing hepatic stellate cells overcomes resistance to anti-angiogenics in colorectal cancer liver metastasis models》的研究成果，該研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深度解析了靶向表達(dá)FAPα的肝星狀細(xì)胞可以克服結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中抗血管生成藥物的耐藥性的分子機(jī)制。該研究發(fā)現(xiàn)貝伐單抗耐藥的腫瘤細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白 1 (FGFBP1)上調(diào)表達(dá)，F(xiàn)GFBP1通過(guò)增強(qiáng)HSCs旁分泌FGF2-FGFR1-ERK1/2EGR1信號(hào)通路誘導(dǎo)FAPα表達(dá)，F(xiàn)APα促進(jìn)肝星狀細(xì)胞（HSC）中CXCL5的分泌，從而激活CXCR2以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和募集骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞產(chǎn)生耐，通過(guò)靶向FAPα⁺ HSC能夠有效的破壞竇狀毛細(xì)血管的選定和克服貝伐單抗耐藥性。中科新生命為其提供了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

研究材料
人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本；結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系；小鼠

技術(shù)路線
步驟1：貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數(shù)量和FAPα蛋白的表達(dá)水平
步驟2：條件性敲除HSCs中FAPα基后探究影響血管選定過(guò)程原因
步驟3：研究FAPα對(duì)MDSC的招募和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響
步驟4：探究FAPα促進(jìn)血管選定的分子機(jī)制
步驟5：闡明結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者貝伐單抗耐藥的分子機(jī)制

結(jié)果部分：

1、貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數(shù)量和HSCs中FAPα基因的表達(dá)水平均升高

研究者通過(guò)異種移植貝伐單抗敏感的HCT116細(xì)胞到小鼠肝臟，然后使用10mg/kg的貝伐單抗處理42天產(chǎn)生耐藥模型，使用貝伐單抗耐藥的細(xì)胞HT-29作為對(duì)照組（Fig1 A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在貝伐單抗耐藥組的病理學(xué)生長(zhǎng)模式以RHGP為主要模式(Fig1 B)，并且免疫熒光結(jié)果顯示貝伐單抗獲得性耐藥的HCT116 CRCLM異種移植模型中發(fā)生血管選定（CD31⁺）的數(shù)量更多(Fig1 C)。通過(guò)進(jìn)一步針對(duì)貝伐單抗耐藥組中出現(xiàn)血管選定的血管特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)APα蛋白主要在αSMA⁺ HSCs表達(dá)，而在對(duì)照組中無(wú)表達(dá)(Fig1 D)。這些結(jié)果提示結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中血管選定導(dǎo)致貝伐單抗耐藥可能與HSCs中FAPα的表達(dá)有關(guān)。

2. FAPα誘導(dǎo)HSCs分泌CXCL5促進(jìn)血管選定

研究者接下來(lái)探索了FAPα在HSCs中對(duì)血管選定的作用。結(jié)果顯示，F(xiàn)APα條件性敲除后血管選定的數(shù)量減少(Fig2 C)，GR-1⁺髓源性抑制性細(xì)胞的募集明顯受到抑制(Fig2 D)，CD8⁺T細(xì)胞的數(shù)量明顯升高(Fig2 E)，F(xiàn)APα條件性敲除后RT-PCR結(jié)果顯示間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白vimentin和N-cadherin的表達(dá)水平顯著下調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin顯著上調(diào)，因此推測(cè)FAPα⁺HSCs可能是通過(guò)預(yù)先建立免疫抑制生態(tài)位，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT促進(jìn)血管選定。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)APα基因過(guò)表達(dá)的肝星狀細(xì)胞系中分泌的細(xì)胞因子CSF2, IL18, CXCL5, IL33, IL1B以及 IL16的表達(dá)水平上調(diào)(Fig3 A)，并且通過(guò)RT-PCR對(duì)上述基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示IL18,CXCL5, IL33和IL1B與測(cè)序結(jié)果相符，并且CXCL5基因的表達(dá)水平升高的最為顯著(Fig3 B)；ELISA結(jié)果顯示在FAPα基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系的培養(yǎng)基上清中CXCL5的含量也升高(Fig3 C)；結(jié)果提示FAPα可能與HSCs分泌CXCL5有關(guān)。因?yàn)槟[瘤來(lái)源的CXCL5能夠通過(guò)激活CXCR2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC募集，因此研究者推測(cè)HSCs來(lái)源的FAPα可能通過(guò)CXCL5-CXCR2軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC的募集，并最終通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了猜想：FAPα誘導(dǎo)HSCs分泌CXCL5細(xì)胞因子激活CXCR2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC募集，從而促進(jìn)血管選定。

3.腫瘤細(xì)胞源性FGFBP1能夠誘導(dǎo)HSCs表達(dá)FAPα促進(jìn)血管選定

為探討HSCs表達(dá)FAPα促進(jìn)血管選定的分子機(jī)制，研究者運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)貝伐株單抗敏感和耐藥的HCT116 CRCLM異種移植腫瘤進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在貝伐單抗耐藥的腫瘤中檢測(cè)到17個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白(Fig4 A)，并且通過(guò)RT-PCR確認(rèn)FGFBP1基因表達(dá)水平也最為顯著(SFig4 A&B)。免疫組化染色、Western blotting和ELISA檢測(cè)顯示，在貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植體系（HCT116和HT-29）的腫瘤組織和原代細(xì)胞中FGFBP1均高表達(dá)(Fig4 B-D)。為探討FGFBP1對(duì)HSCs中FAPα表達(dá)和血管選定的作用機(jī)制，在HCT116細(xì)胞上構(gòu)建了FGFBP1基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，在HT-29細(xì)胞上構(gòu)建了FGFBP1基因干擾表達(dá)細(xì)胞系，HE染色結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)FGFBP1后RHGP的比率顯著升高，相反，干擾FGFBP1的表達(dá)之后RHGP的比率顯著降低(Fig4 E)。同時(shí)，在免疫熒光結(jié)果中過(guò)表達(dá)FGFBP1后血管選定的數(shù)量和陽(yáng)性表達(dá)FAPα蛋白的HSCs數(shù)量也顯著增多，干擾之后數(shù)量就會(huì)減少(Fig4 F，G)。

4、FGFBP1能夠通過(guò)FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1軸誘導(dǎo)HSCs表達(dá)FAPα蛋白

接下來(lái)，研究者針對(duì)FGFBP1誘導(dǎo)HSCs表達(dá)FAPα蛋白的機(jī)制展開(kāi)探索，由于FGFBP1能夠通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）釋放FGF2來(lái)增強(qiáng)FGFR1信號(hào)通路，所以研究者檢測(cè)了LX-2細(xì)胞系中FGF2和FGFR1的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其確實(shí)高于其他的FGFs和FGFRs（sFig6 A，B）。另外，F(xiàn)GF2和磷酸化的FGFR1在陽(yáng)性表達(dá)FAPα蛋白的HSCs中表達(dá)水平升高（sFig6 C），說(shuō)明FGFBP1可能是通過(guò)FGF2-FGFR1信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)HSCs表達(dá)FAPα蛋白的。鑒于ERK1/2-EGR1軸位于FGFR1的下游，而EGR1能夠與FAP基因的啟動(dòng)子結(jié)合誘導(dǎo)FAPα的表達(dá)，所以研究者認(rèn)為FGFR1激活誘導(dǎo)HSCs中FAPα的表達(dá)可能受ERK1/2-ERG1軸的調(diào)控。因此研究者就通過(guò)WB檢測(cè)了FGFR1和ERK1/2的磷酸化狀態(tài)以及EGR1和FAPα的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)FGFBP1過(guò)表達(dá)之后這些標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（Fig5 A）。此外，敲除RGR1基因后FAPα的表達(dá)水平顯著下調(diào)（Fig5 D），進(jìn)一步對(duì)研究的猜想進(jìn)行了驗(yàn)證。

緊接著，研究者通過(guò)一系列的細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法，進(jìn)一步探究了FGF2-FGFR1-FAPα途徑在促進(jìn)貝伐單抗誘導(dǎo)的血管選定的作用后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1的激活可能是依賴于FAPα誘導(dǎo)HSCs分泌趨化因子CXCL5促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT和MDSC招募，從而促進(jìn)血管選定過(guò)程。并且這一結(jié)果也在臨床結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中進(jìn)行了驗(yàn)證，此外，該研究的最后使用了研究者實(shí)驗(yàn)室合成FAPα活化的前體藥物Z-GP-DAVLBH，數(shù)據(jù)表明Z-gp-DAVLBH能選擇性誘導(dǎo)FAPα⁺HSCs細(xì)胞凋亡，擾亂血管選定，克服血管選定介導(dǎo)的貝伐單抗單抗治療耐藥。

總結(jié)

本文通過(guò)運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行前期數(shù)據(jù)探索性挖掘，并結(jié)合細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)揭示了貝伐單抗耐藥的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)FGFBP1 ，并通過(guò)FGFBP1-FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1通路誘導(dǎo)HSCs中FAPα蛋白的表達(dá)，F(xiàn)APα進(jìn)而促進(jìn)HSCs中CXCL5的分泌后激活CXCR2來(lái)增強(qiáng)MDSC的浸潤(rùn)和腫瘤細(xì)胞EMT，最終促進(jìn)血管選定。此外，用FAPα激活的前藥物Z-GP-DAVLBH靶向FAPα⁺HSCs有效地克服了血管選定介導(dǎo)的CRCLM對(duì)抗血管生成治療的耐藥性，提供了潛在的治療策略和藥物候選。

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