親和層析法分離和純化蛋白技術(shù)介紹及常見問題和故障排除
親和色譜依賴于蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合配體的特異性和可逆結(jié)合。配體可以直接與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合，例如，用于結(jié)合 cAMP 的 PKA RIα 和 RIIβ 蛋白質(zhì)的 cAMP 樹脂，或與蛋白質(zhì)共價(jià)連接的標(biāo)簽。親和層析是常用的蛋白質(zhì)純化程序，通常用于純化方案的初始階段。根據(jù)下游應(yīng)用，親和純化是獲得足夠純度重要方法。
在這兩種類型的親和層析中，蛋白質(zhì)在影響蛋白質(zhì)（或標(biāo)簽）與其配體之間結(jié)合的條件下被加載到柱子上。在不破壞特定相互作用但會(huì)破壞污染蛋白質(zhì)和固定相之間的任何非特異性相互作用的條件下洗滌結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后用含有競爭分子或破壞所有蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的條件的緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。競爭分子與配體結(jié)合，取代感興趣的蛋白質(zhì)。這種競爭分子通常通過另一個(gè)色譜程序或透析從感興趣的蛋白質(zhì)中去除。通過破壞所有蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用從固定相洗脫蛋白質(zhì)的方法包括調(diào)整緩沖液的 pH 值或離子強(qiáng)度。這些方法會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，建議立即中和或稀釋洗脫的蛋白質(zhì)，以盡量減少蛋白質(zhì)損傷。
在設(shè)計(jì)用于蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)粒時(shí)，可以將親和標(biāo)簽插入到 N 端或 C 端（或在少數(shù)情況下，插入具有已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的柔性環(huán)中）以幫助純化�？贵w通常基于抗體與其抗原（抗體識(shí)別的序列）之間發(fā)生的高度特異性相互作用進(jìn)行純化�？梢詫⒑锌乖碾呐c基質(zhì)偶聯(lián)以特異性結(jié)合抗體。降低洗脫緩沖液的 pH 值會(huì)破壞抗體/肽相互作用以釋放結(jié)合的抗體。這種方法通常在商業(yè)上用于從粗血清中分離抗體。
圖 2.離子交換色譜。蛋白質(zhì)以低離子強(qiáng)度與帶電固定相結(jié)合。可通過增加緩沖液的離子強(qiáng)度或通過調(diào)節(jié) pH 值來洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)也可以以非選擇性方式進(jìn)行親和純化。在非選擇性純化中，附著在固定相上的配體與具有相似結(jié)合配偶體的一組蛋白質(zhì)結(jié)合。
非選擇性親和純化，比如： DNA 結(jié)合蛋白的純化。肝素在結(jié)構(gòu)和電荷上都模擬 DNA，可用作親和純化 DNA 結(jié)合蛋白的配體。雖然理論上所有的 DNA 結(jié)合蛋白都可以與這個(gè)固定相結(jié)合，但大多數(shù)其他蛋白質(zhì)會(huì)在沒有結(jié)合的情況下流過，從而導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)充分富集。另一個(gè)例子是通過將抗體的恒定 (Fc) 區(qū)與配體、蛋白 A、G 或 L 結(jié)合來富集抗體。對(duì)于 IgM，可以使用魚精蛋白親和層析。
使用類似的結(jié)合模式（抗體與蛋白 A、G 或 L 配體結(jié)合），抗體的抗原結(jié)合 (Fab) 區(qū)域仍可用于與其特異性抗原結(jié)合。因此，可以基于偶聯(lián)的配體/抗體和抗體/抗原之間的特異性相互作用來純化特定的蛋白質(zhì)。
常見問題和故障排除
蘇州阿爾法生物提供的 組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì)金屬螯合親和層析法的蛋白純化實(shí)驗(yàn)中，另外提供 GST-tag蛋白親和純化介質(zhì)， MBP-tag蛋白親和純化介質(zhì)， 生物素 Biotin-tag蛋白親和純化介質(zhì)，Strep-tagll標(biāo)簽親和純化介質(zhì) ， 標(biāo)簽抗體親和純化介質(zhì)， 離子交換層析介質(zhì)， 疏水層析介質(zhì) ， 磁性微球 ，瓊脂糖凝膠過濾介質(zhì)， 葡聚糖凝膠過濾介質(zhì) 等蛋白純化介質(zhì)填料。
上圖.蛋白質(zhì)上的凈電荷受其溶劑 pH 值的影響。在 pH=pI 時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，因此不會(huì)與陽離子交換或陰離子交換固定相結(jié)合。將 pH 值調(diào)整為高于或低于蛋白質(zhì)的 pI 將導(dǎo)致凈電荷，并且蛋白質(zhì)與陰離子交換 (pH > pI) 或陽離子交換 (pH < pI) 固定相結(jié)合。
用于親和層析的固定相由共價(jià)連接到配體的惰性基質(zhì)制成，該配體與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組特異性結(jié)合。惰性基質(zhì)通常由交聯(lián)的瓊脂糖或聚丙烯酰胺組成。可以通過親和層析以選擇性或非選擇性方式純化蛋白質(zhì)。在選擇性親和層析中，使用對(duì)蛋白質(zhì)特異的配體或共價(jià)連接的標(biāo)簽。在非選擇性親和層析中，例如用于免疫球蛋白的蛋白 A、G、L，或用于 DNA 結(jié)合蛋白的肝素，或用于糖蛋白的凝集素，配體與具有相似結(jié)合能力的一組蛋白質(zhì)結(jié)合。例如，通過扁豆凝集素親和柱層析純化表達(dá)以生產(chǎn) SARS-CoV-2 S 包膜蛋白 。在這兩種類型的親和層析中，蛋白質(zhì)在影響蛋白質(zhì)（或標(biāo)簽）與其配體之間結(jié)合的條件下被加載到柱子上。在不破壞特定相互作用但會(huì)破壞污染蛋白質(zhì)和固定相之間的任何非特異性相互作用的條件下洗滌結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后用含有競爭分子或破壞所有蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的條件的緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。競爭分子與配體結(jié)合，取代感興趣的蛋白質(zhì)。這種競爭分子通常通過另一個(gè)色譜程序或透析從感興趣的蛋白質(zhì)中去除。通過破壞所有蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用從固定相洗脫蛋白質(zhì)的方法包括調(diào)整緩沖液的 pH 值或離子強(qiáng)度。這些方法會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，建議立即中和或稀釋洗脫的蛋白質(zhì)，以盡量減少蛋白質(zhì)損傷。
| 蛋白質(zhì)純化 | 配體 | 洗脫 |
| 抗體（抗原特異性） | 抗原肽 | 游離肽 |
| 多組氨酸標(biāo)簽蛋白 | Ni 2+或 Co 2+ | 咪唑或游離組氨酸 |
| 標(biāo)記蛋白 | FLAG 特異性抗體 | FLAG肽或低pH |
| GST標(biāo)簽蛋白 | 還原型谷胱甘肽 | 游離谷胱甘肽 |
| Myc標(biāo)簽蛋白 | Myc 特異性抗體 | 低 pH |
| 抗體（特定類別） | 蛋白質(zhì) A、G 或 L 或魚精蛋白 | 極端的 pH 值 |
| DNA結(jié)合蛋白 | 肝素 | 高離子強(qiáng)度 |
表 1。具有用于特異性和典型洗脫條件的官能團(tuán)（配體）的選擇性和非選擇性親和色譜的示例。
在設(shè)計(jì)用于蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)粒時(shí)，可以將親和標(biāo)簽插入到 N 端或 C 端（或在少數(shù)情況下，插入具有已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的柔性環(huán)中）以幫助純化�？贵w通常基于抗體與其抗原（抗體識(shí)別的序列）之間發(fā)生的高度特異性相互作用進(jìn)行純化�？梢詫⒑锌乖碾呐c基質(zhì)偶聯(lián)以特異性結(jié)合抗體。降低洗脫緩沖液的 pH 值會(huì)破壞抗體/肽相互作用以釋放結(jié)合的抗體。這種方法通常在商業(yè)上用于從粗血清中分離抗體。
蛋白質(zhì)也可以以非選擇性方式進(jìn)行親和純化。在非選擇性純化中，附著在固定相上的配體與具有相似結(jié)合配偶體的一組蛋白質(zhì)結(jié)合。
非選擇性親和純化，比如： DNA 結(jié)合蛋白的純化。肝素在結(jié)構(gòu)和電荷上都模擬 DNA，可用作親和純化 DNA 結(jié)合蛋白的配體。雖然理論上所有的 DNA 結(jié)合蛋白都可以與這個(gè)固定相結(jié)合，但大多數(shù)其他蛋白質(zhì)會(huì)在沒有結(jié)合的情況下流過，從而導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)充分富集。另一個(gè)例子是通過將抗體的恒定 (Fc) 區(qū)與配體、蛋白 A、G 或 L 結(jié)合來富集抗體。對(duì)于 IgM，可以使用魚精蛋白親和層析。
使用類似的結(jié)合模式（抗體與蛋白 A、G 或 L 配體結(jié)合），抗體的抗原結(jié)合 (Fab) 區(qū)域仍可用于與其特異性抗原結(jié)合。因此，可以基于偶聯(lián)的配體/抗體和抗體/抗原之間的特異性相互作用來純化特定的蛋白質(zhì)。
常見問題和故障排除
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
| 蛋白質(zhì)不結(jié)合 | 標(biāo)簽未翻譯或不可訪問 | 檢查質(zhì)粒序列或?qū)?biāo)簽移動(dòng)到不同的位置 |
| 約束條件不合適 | 調(diào)整緩沖條件 | |
| 沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行綁定 | 降低流速或停止色譜柱以允許孵育 | |
| 蛋白質(zhì)不洗脫 | 配體和標(biāo)簽之間的親和力非常高 | 增加競爭對(duì)手的集中度（特定）或條件的嚴(yán)格性（非特定） |
| 蛋白質(zhì)聚集在柱子上 | 調(diào)整緩沖液條件以獲得更高的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性 | |
| 低分辨率 | 流速太快或太慢 | 調(diào)整流量 |
| 色譜柱未充分清洗 | 用更嚴(yán)格的緩沖液洗滌；根據(jù)制造商清潔固定相 | |
| 蛋白質(zhì)聚集在柱子上 | 調(diào)整緩沖液條件以獲得更高的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性 | |
| 洗脫條件不夠嚴(yán)格 | 提高競爭對(duì)手的集中度（特定）或調(diào)整條件（非特定） | |
| 蛋白質(zhì)在手術(shù)過程中失去活性 | 蛋白質(zhì)未折疊或聚集 | 調(diào)整緩沖液條件以獲得更高的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性 |
| 在純化過程中去除了活性所需的輔助因子 | 添加輔因子 |
蘇州阿爾法生物提供的 組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì)金屬螯合親和層析法的蛋白純化實(shí)驗(yàn)中，另外提供 GST-tag蛋白親和純化介質(zhì)， MBP-tag蛋白親和純化介質(zhì)， 生物素 Biotin-tag蛋白親和純化介質(zhì)，Strep-tagll標(biāo)簽親和純化介質(zhì) ， 標(biāo)簽抗體親和純化介質(zhì)， 離子交換層析介質(zhì)， 疏水層析介質(zhì) ， 磁性微球 ，瓊脂糖凝膠過濾介質(zhì)， 葡聚糖凝膠過濾介質(zhì) 等蛋白純化介質(zhì)填料。
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