文章標(biāo)題：Impact of prolonged withering on phenolic compounds and antioxidant capability in white tea using LC-MS-based metabolomics and HPLC analysis: Comparison with green tea

發(fā)表期刊：Food Chemistry

發(fā)表時(shí)間：2021.8

影響因子：7.514

合作單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)院

百趣生物提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)—親水版

研究背景
茶是世界上最受歡迎和廣泛消費(fèi)的飲品之一。如果將中國茶葉按照加工工藝進(jìn)行劃分，可分為綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶、黑茶六類。在中國河南省的信陽地區(qū)，生長(zhǎng)著信陽品種茶葉，可以用于生產(chǎn)綠茶、白茶、紅茶和黑茶。由于白茶具有特殊的品質(zhì)和多種有益的作用，目前研究對(duì)探討了白茶的健康功效和化學(xué)成分十分關(guān)注，并證實(shí)了白茶化學(xué)成分介于綠茶和紅茶之間，但是綠茶和白茶之間的化學(xué)成分和抗氧化能力的差異尚未明確和定義。本文旨在采用LC-MS非靶向代謝組學(xué)，比較加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)因素對(duì)白茶和綠茶代謝物的影響。并進(jìn)一步采用鐵還原能力(FRAP)、ABTS自由基清除能力(ABTS)、羥基自由基清除能力(HSA)和DPPH清除能力(DPPH) 4種方法評(píng)價(jià)白茶的體外抗氧化活性。

通過研究加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)對(duì)茶的生物活性成分、代謝組學(xué)代謝物成分和抗氧化能力的影響，文章揭示了綠茶和白茶在化學(xué)成分和抗氧化活性方面存在明顯差異，并證實(shí)了長(zhǎng)時(shí)間萎凋?qū)Π撞柚蟹宇惢�合��、氨基酸、糖和嘌呤生物堿有著顯著影響。

研究結(jié)果
1加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)對(duì)酚類化合物和嘌呤生物堿的影響
 

圖1. 茶樣中的生物活性化合物分析

根據(jù)加工工藝不同，將茶葉樣本分為綠茶（GT）和白茶（WT）兩組，再按生產(chǎn)季節(jié)將同樣的樣本分為春茶（ST）和夏秋茶（SFT）。

根據(jù)HPLC技術(shù)對(duì)20種生物活性化合物進(jìn)行檢測(cè)，PCA（圖1A）和HCA（圖1B）的結(jié)果體現(xiàn)出綠茶和白茶兩組之間存在顯著差異，所以依據(jù)加工工藝實(shí)現(xiàn)茶葉分類，對(duì)綠茶和白茶樣本進(jìn)行區(qū)分是可行的。此外，HCA顯示春季生產(chǎn)的白茶可以單獨(dú)歸為一組，與夏秋季生產(chǎn)的白茶有著明顯區(qū)分，這證實(shí)了生產(chǎn)季節(jié)確實(shí)會(huì)明顯影響白茶的化學(xué)成分。熱圖（圖1C）結(jié)果將20個(gè)化學(xué)成分分為2類。在第I類成分中，白茶的6種黃酮類、咖啡因和茶堿的含量相對(duì)高于綠茶。而在第II類成分中，綠茶的兒茶素8種、酚酸2種、1，4，6-三烷基β-D-葡萄糖（GG）和可可堿的含量相對(duì)較高。

加工工藝使得綠茶和白茶之間有15種化合物呈顯著差異（p<0.05，p<0.01，或p<0.001），包括6種兒茶素、2種酚酸、4種黃酮碘、GG和2種嘌呤生物堿。與綠茶相比，白茶有6種兒茶素（C、EC、ECG、GCG、CG和EGCG）、2種酚酸（GA和EA）、GG和可可堿含量較低，但4種黃酮類物質(zhì)和咖啡因含量顯著升高（p<0.05）�？傮w而言，結(jié)果表明，白茶的長(zhǎng)時(shí)間萎凋促進(jìn)了兒茶素和酚酸的降解，同時(shí)促進(jìn)了黃酮類化合物和嘌呤生物堿的積累。

生產(chǎn)季節(jié)對(duì)兒茶素和類黃酮化合物的影響顯著。與春茶相比，夏秋茶中4種兒茶素和3種黃酮類化合物的水平均有顯著性增加，特別是EGC、山奈酚和楊梅素（p<0.001）。溫度越高和光照強(qiáng)度越強(qiáng)促進(jìn)了夏秋茶中兒茶素和黃酮類化合物的積累。

2茶的整體代謝組學(xué)代謝物分布特征分析

圖2. 茶樣中的整體代謝物分析

通過對(duì)非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)到的1189種代謝組學(xué)代謝物進(jìn)行分析，PCA和HCA的結(jié)果同樣體現(xiàn)出綠茶與白茶組之間差異明顯，加工工藝是良好的分類準(zhǔn)則，能夠?qū)⒉璺譃榫G茶組和白茶組（圖2）。在PCA中可以了解到，春茶與夏秋茶也存在明顯差異。而在HCA中，春季生產(chǎn)的白茶與綠茶聚集在一起（圖2B），表示它們?cè)诨瘜W(xué)成分上有高度相似性。盡管加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)都影響著茶葉的化學(xué)成分，但結(jié)果來看大部分綠茶還是難以依據(jù)生產(chǎn)季節(jié)進(jìn)行分類。
 

圖3. 加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)對(duì)茶中代謝物的影響
 

綠茶與白茶的對(duì)比結(jié)果中，有179種分化代謝物（圖3C）的FC值小于0.1，表明白茶的長(zhǎng)時(shí)間萎凋有助于特定代謝物的積累或產(chǎn)生，如游離氨基酸、類黃酮苷和茶黃素。KEGG代謝途徑分析，強(qiáng)調(diào)了加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)會(huì)顯著影響氨基酸代謝，黃酮和黃酮醇的生物合成，以及類黃酮的生物合成。

3白茶的萎凋?qū)Υ�謝組學(xué)代謝物成分的影響

圖4. 熱圖展示綠茶和白茶之間的顯著差異代謝物，酚類化合物(A)、氨基酸、糖和嘌呤生物堿(B)

在代謝組檢測(cè)到的1189種代謝物中，59種酚類化合物和45種氨基酸及其衍生物存在差異顯著（VIP>1、p<0.05和FC>1.50或FC<0.66）。這可能是由于白茶萎凋時(shí)間長(zhǎng)，部分保留了酶活性，如多酚氧化酶、漆酶和過氧化物酶。從熱圖（圖4）結(jié)果上可以看出，綠茶和白茶之間酚類化合物、氨基酸、糖和嘌呤生物堿有著一定差異。

a)酚類化合物
如圖4A所示，兩種白茶中茶黃素、茶黃素3、3’-雙甲酸酯和異茶黃素3’-沒食子酸酯等茶黃素含量迅速升高，比綠茶高2.67-9.01倍，而大部分兒茶素水平顯著下降。長(zhǎng)時(shí)間萎凋?qū)е铝税�括酯類兒茶素在�?nèi)的兒茶素極顯著的下降，黃酮類物質(zhì)的顯著上調(diào)證實(shí)發(fā)酵和酶水解促進(jìn)類黃酮的產(chǎn)量，如皇后素和山奈酚。后續(xù)白茶加工過程中黃酮類和黃酮苷的代謝機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

b)氨基酸
以往的研究表明，綠茶中總游離氨基酸和幾種游離氨基酸的含量較高。在紅茶酶促發(fā)酵和紅茶微生物發(fā)酵過程中，游離氨基酸總含量均呈下降趨勢(shì)。由于在白茶過程中蛋白質(zhì)的降解，白茶比綠茶和紅茶含有更豐富的游離氨基酸。

相比之下（圖4），白茶中亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的趨勢(shì)顯著下降， 而其他游離氨基酸顯示顯著增加，特別是異亮氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸等增加了2倍以上，其中顯著增加的代謝物主要來自于左-多巴3‘-葡萄糖苷的水解。此外，白茶中γ-氨基丁酸的含量顯著高于綠茶，其原因并不是由于在厭氧處理下的多胺降解途徑產(chǎn)生γ-氨基丁酸大量積累，γ-氨基丁酸主要是由谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸產(chǎn)生的。

c)糖和嘌呤生物堿
在代謝組學(xué)檢測(cè)到的39種糖類中，有4種糖類含量在白茶中顯著降低，特別是4-葡萄糖醛酸大幅下降。另外由于白茶在長(zhǎng)時(shí)間萎凋過程中，纖維素和半纖維素發(fā)生了降解，使得有12種糖類的含量顯著增加，且白茶中咖啡因含量也呈上升趨勢(shì)。由于咖啡因的氧化，茶堿、7-三甲基尿酸也顯著升高，此外其他嘌呤生物堿、7-甲基黃嘌呤和3-甲基黃嘌呤均呈下降趨勢(shì)。

4茶的抗氧化能力及其與生物活性物質(zhì)的相關(guān)性
本研究采用FRAP、ABTS、DPPH和HSA4種抗氧化性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)茶的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。綠茶和白茶之間，除HSA無顯著性差異外，F(xiàn)RAP、ABTS和DPPH（圖5a）結(jié)果都顯示了顯著差異。而且白茶則DPPH值顯著高，這應(yīng)該是由于白茶和綠茶中兒茶素、酚類酸和類黃酮等酚類化合物的差異所致。
 

圖5. 綠茶和白茶的抗氧化活性及其與生物活性化合物的相關(guān)性分析
 

除了EGCG被認(rèn)為是茶中最強(qiáng)的抗氧化劑外，GA和黃酮類物質(zhì)，如山奈酚也有助于茶的體外抗氧化能力。雙變量相關(guān)性分析（圖5B）發(fā)現(xiàn)C、EC、EGC、ECG、CG、EGCG等兒茶素類物質(zhì)與FRAP和ABTS呈顯著正相關(guān)。

此外，山奈酚和杉木素與DPPH呈正相關(guān)，據(jù)此推測(cè)山奈酚和杉木素等類黃酮類物質(zhì)能夠提高白茶的DPPH自由基清除能力。GA對(duì)抗氧化活性有一定的影響，與FRAP呈顯著正相關(guān)，但和DPPH呈負(fù)相關(guān)的情況。咖啡因和可可堿與FRAP、DPPH和HSA呈一定關(guān)聯(lián)，顯示嘌呤生物堿也影響抗氧化能力。正是這些化學(xué)成分使得綠茶和白茶的抗氧化活性差異顯著。

結(jié)論
通過對(duì)河南信陽地區(qū)所產(chǎn)茶的研究，本文證實(shí)了加工工藝是影響化學(xué)成分的主要因素，可以根據(jù)加工工藝將茶葉劃分為綠茶和白茶。春季生產(chǎn)的白茶與綠茶的化學(xué)成分相似，并且白茶長(zhǎng)時(shí)間萎凋會(huì)導(dǎo)致茶葉成分發(fā)生顯著差異變化，而這些特征成分和差異的代謝物可用于茶葉生產(chǎn)季節(jié)和加工工藝的鑒定。

結(jié)合白茶的抗氧化能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)綠茶和白茶的生物活性成分、代謝組學(xué)代謝物成分和抗氧化能力存在明顯差異，白茶的長(zhǎng)時(shí)間萎凋?qū)ζ浠瘜W(xué)成分和抗氧化活性有著顯著影響。

文/阿趣代謝組學(xué)