熱原（內(nèi)毒素）檢測

鑒于熱原對人體的不良反應(yīng)的效果和多樣性，注射用藥終產(chǎn)品放行都必須強(qiáng)制進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素測試（BETs），以確�；颊哂盟幇踩�。在制藥行業(yè)，特別是注射用藥，對細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行可靠和有效的檢測是重要環(huán)節(jié)。標(biāo)記為無熱原或無菌的注射或植入產(chǎn)品必須進(jìn)行內(nèi)毒素檢測放行。許多原材料檢查也必須進(jìn)行內(nèi)毒素檢測方能用于GMP生產(chǎn)，以達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量要求。

家兔熱原檢測法（RPT）

家兔的體溫變化非常敏感，它們對許多病毒和致病菌非常敏感，具有能客觀反映各類藥品中熱原在生物體內(nèi)引起發(fā)熱情況的特點(diǎn)。通過家兔的預(yù)先感染，可以進(jìn)行許多抗傳染藥物的研究，因此可以作為熱原試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，常作為研究發(fā)熱、解熱藥和檢查致熱原。雖然兔子是最常用的試驗(yàn)動(dòng)物，但人類被認(rèn)為是對熱原最敏感的動(dòng)物。

Seibert在1923提出用家兔檢測熱原，該方法于1942年首次被美國藥典收錄，簡稱“家兔法”（RPT），是用于藥品和醫(yī)療器械熱原體內(nèi)檢測的方法。中國藥典1953年版開始收載該方法，隨后的世界各國藥典都以動(dòng)物熱原檢查法作為藥品質(zhì)量監(jiān)測的方法之一。歐洲藥典也于1986年首次發(fā)布該方法，通過測量兔子通過靜脈注射待測物質(zhì)的無菌溶液引起的體溫升高進(jìn)行檢測。家兔熱原檢查法可在規(guī)定時(shí)間里觀察到家兔的體溫變化，相應(yīng)反應(yīng)了熱原質(zhì)引起哺乳類動(dòng)物復(fù)雜的體溫反應(yīng)過程，為保障藥品質(zhì)量和用藥安全發(fā)揮了重要作用。

單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法(MAT)

但RPT也存在各種局限性，例如：靈敏度較低、無法區(qū)分Endotoxin和NEP；試驗(yàn)動(dòng)物受到藥品的藥理活性干擾，而影響體溫變化（如放射性藥品、抗生素、生物制品等），實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以判斷；無法應(yīng)用于非靜脈注射藥物；兔子致命的過敏性休克的可能性；動(dòng)物飼養(yǎng)和測試設(shè)備及實(shí)驗(yàn)費(fèi)用；屬于定性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和熱原很難進(jìn)行量的換算。

鑒于這些限制，以及歐盟為減少動(dòng)物用于科學(xué)目的所做的努力，歐洲藥典2010在通則2.6.30新增單核細(xì)胞活化試驗(yàn)(MAT)熱原檢測方法，為RPT提供了一種體外替代方案，能夠檢測內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩�，在�?dòng)物福利方面向前邁出的重要一步。USP<151>也收錄了MAT熱原檢測方法。2020年版《中國藥典》通則9301“注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”中增加單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法(MAT)方法。用于滿足技術(shù)藥物發(fā)展的現(xiàn)狀和解決傳統(tǒng)內(nèi)毒素檢查法不能滿足新型產(chǎn)品安全性控制需求這個(gè)難題。
 

單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法(MAT)原理

細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法（LAL/TAL）

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法又稱鱟試劑法，是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)，以檢測或量化藥品中因革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素含量是否符合規(guī)定的一種方法。此法以其快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)得到了日益廣泛的應(yīng)用，并有取代傳統(tǒng)的熱原檢查法的發(fā)展趨勢。
 

美國動(dòng)物學(xué)家FredericBang在1956年研究鱟的血液循環(huán)時(shí)，和助手JackLevin發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素導(dǎo)致的凝血機(jī)理。1968年，他們初步闡明這種血液凝固是由于革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素激活了鱟血變形細(xì)胞溶解物的酶，使溶解物中的可溶性蛋白變成凝膠，這種凝固反應(yīng)極其靈敏。開發(fā)出了一種的細(xì)菌檢測劑——鱟試劑（LAL，LimulusAmebocyte Lysate，鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物）。
 

內(nèi)毒素檢測方法發(fā)展史

根據(jù)鱟血來源不同，一般分為LAL（美洲鱟試劑）/TAL（東方鱟鱟試劑），鱟試劑檢測法是一種可靠、靈敏、特異性強(qiáng)的內(nèi)毒素檢測方法，也是監(jiān)管機(jī)構(gòu)主要的推薦方法，應(yīng)用廣泛。基于鱟試劑發(fā)展出來的主要內(nèi)毒素檢測方法包括兩種：凝膠法和光度測定法，后者又包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試樣品檢測時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法檢測結(jié)果為準(zhǔn)。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EndotoxinUnit, EU）表示。

模擬鱟試驗(yàn)級聯(lián)反應(yīng)階段，2003年以來，基于重組因子C（rFC）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法由于可替代動(dòng)物源鱟試劑和原料可控性、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用作內(nèi)毒素檢測的替代方法。有研究比較了LAL方法和rFC檢測數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示幾種方法的檢測結(jié)果是可比的。重組C因子內(nèi)毒素檢測方法可以用于藥典凝膠法和光度法的有效替代。
 

不同鱟試劑檢測方法和重組C因子檢測方法檢測結(jié)果比較(KQCL-Lonza動(dòng)態(tài)顯色法試劑盒；PyroGene-Lonza重組C因子法試劑盒；QCL-Lonza終點(diǎn)顯色法試劑盒；Turb-Lonza動(dòng)態(tài)濁度法試劑盒)

因此，目前行業(yè)內(nèi)共有四種常見的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法：凝膠法、比濁法、顯色法和rFC法，并在注射劑和醫(yī)療器械生產(chǎn)過程控制和產(chǎn)品放行質(zhì)控檢測中有著重要的應(yīng)用。比濁法、顯色法和rFC法是定量方法，凝膠法為定性或者半定量方法。每種方法都有自己的特點(diǎn)，使用者可以根據(jù)自己的樣品屬性、檢測需求和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備情況和法規(guī)要求進(jìn)行相應(yīng)選擇，以達(dá)到內(nèi)毒素控制和熱原控制的效果，保證患者安全。
 

內(nèi)毒素檢測方法

Lonza內(nèi)毒素檢測產(chǎn)品一直走在行業(yè)尖端

Lonza（龍沙）內(nèi)毒素產(chǎn)品于1970年代面世。半個(gè)世紀(jì)以來，為全球客戶提供包括細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑盒、內(nèi)毒素檢測軟件、全自動(dòng)內(nèi)毒素檢測儀器在內(nèi)的一站式解決方案，符合FDA21 CFR part 11和歐盟EUGMP附錄11法規(guī)要求，以服務(wù)于各類細(xì)胞制劑生產(chǎn)企業(yè)、制藥企業(yè)質(zhì)控部門，可植入醫(yī)療設(shè)備和透析樣品質(zhì)控以及科研院所等相關(guān)機(jī)構(gòu)，其服務(wù)對象覆蓋70%的制藥100強(qiáng)企業(yè)，已用于國外大量藥物的放行上市，滿足出口型制藥企業(yè)的規(guī)�；療嵩礈y定需求。
 

產(chǎn)品包括：鱟試劑凝膠法試劑盒；基于鱟試劑，用于定量檢測的動(dòng)態(tài)顯色法試劑盒，動(dòng)態(tài)濁度法試劑盒；不依賴于鱟試劑的重組C因子檢測試劑盒。LAL試劑可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的穩(wěn)定供應(yīng)。
 

此外，Lonza還提供PyroCell®MAT單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法系統(tǒng)，高度敏感和可靠的用于復(fù)雜配方（如人類疫苗和基于細(xì)胞的生物制劑）的體外熱原檢測。
 

Lonza內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)及組成（試劑盒、軟件、儀器、自動(dòng)化及周邊耗材試劑）