抑郁癥是一種常見的精神障礙疾病，影響人群超過3億，它是導致殘疾的主要原因之一。然而，抑郁癥相關機制尚不清楚。近年來，腸-腦軸被認為是抑郁癥的新靶點，但缺乏關于抑郁癥-腸道菌群的縱向研究。來自西班牙的José Manuel Fernández-Real和Rafael Maldonado團隊通過多隊列臨床樣本和多組學方法來揭示依賴于腸道菌群的脯氨酸代謝變化對抑郁癥的影響，并提示靶向菌群/膳食脯氨酸或可有效改善抑郁，相關研究成果發(fā)表于《Cell Metabolism》。

研究重點解析

1. 膳食和血漿脯氨酸與抑郁嚴重程度顯著正相關

2. 血漿脯氨酸水平取決于腸道菌群組成和功能

3. 補充脯氨酸加劇小鼠抑郁樣行為

4. 腦鐵沉積和rich-club網絡破壞與抑郁和脯氨酸有關

5. 糞菌移植促進小鼠抑郁并增加脯氨酸/GABA轉運蛋白基因水平

6. 敲低脯氨酸/GABA轉運蛋白基因可抵御果蠅抑郁狀態(tài)

7. 植物乳桿菌的單菌定植可改善果蠅抑郁狀態(tài)

宏基因組揭示抑郁評分相關特定菌群及功能

首先對縱向發(fā)現隊列（IRONMET，n=116）糞便樣本進行宏基因組分析，其中非抑郁癥（n=44)、輕度抑郁(n=47)和重度抑郁受試者(n=25)，結合抑郁篩查量表評分（PHQ-9）篩選菌群組成和功能與抑郁癥的關系。結果顯示，alpha多樣性指數或香農指數在組間無顯著差異；然而，非抑郁個體的Fisher’ alpha多樣性指數高于抑郁個體，在輕度和重度抑郁癥之間無顯著差異。β多樣性的主成分分析(PCA)結果表明，非抑郁受試者和抑郁受試者之間菌群組成存在顯著差異。對于每個分類群經年齡、性別、體重指數(BMI)、受教育年限以及抗抑郁藥和焦慮藥物校正后，篩選出30種與抑郁癥顯著相關的菌種。其中，PHQ-9評分與Parabacteroides spp.、Acidaminococcus spp.呈正相關，而與Bifidobacterium pseudolongum和毛螺菌科中產丁酸鹽的菌種呈負相關�？v向比較表明，較低水平的放線菌（雙歧桿菌屬和柯林斯菌）和毛螺菌以及較高水平的普雷沃氏菌和腸桿菌與1年后較高的PHQ-9評分有關。

在功能上，經年齡、性別、BMI、教育年限、抗抑郁藥和抗焦慮藥校正后，與PHQ-9評分顯著相關的菌群功能涉及精氨酸、脯氨酸和組氨酸代謝通路且與PHQ-9評分呈負相關，此外，谷氨酸代謝、谷氨酸能突觸和GABA能突觸與PHQ-9評分顯著相關。一些具有強關聯的細菌也參與了TCA循環(huán)。溶質載體家族6(SLC6)也與PHQ-9評分呈負相關。其中，SLC6主要編碼神經遞質（例如GABA、單胺、甘氨酸和脯氨酸）轉運蛋白，也編碼蛋白氨基酸、甜菜堿、�；撬岷图∷幔▓D1），與GABA能突觸變化一致。

圖1. 抑郁癥評分相關腸道菌群組成和功能變化

代謝組學揭示抑郁評分與組氨酸、精氨酸、脯氨酸降解通路有關

對血漿和糞便樣本進行代謝組學分析，基于機器學習變量選擇策略篩選出幾種與PHQ-9評分相關的代謝物，這些代謝物參與了TCA循環(huán)（琥珀酸和富馬酸）、組氨酸代謝（尿刊酸）以及脯氨酸和谷氨酸代謝，與之前研究結果一致。隨后，通過另一個獨立驗證隊列（IMAGEOMICS，n=919）血漿樣本進行驗證，該隊列也由非抑郁、輕度和重度抑郁受試者組成。其中兩個隊列一致發(fā)現血漿脯氨酸與抑郁評分的強正相關。將發(fā)現隊列（IRONMET）中與PHQ-9評分顯著相關的代謝物進行通路富集分析，結果表明，TCA循環(huán)、氧化磷酸化、谷氨酸代謝以及精氨酸、脯氨酸和組氨酸分解代謝相關的通路顯著富集，結果也強調了SLC和氨基酸轉運蛋白以及GABA合成/降解通路及其通過GABA分流與TCA循環(huán)的聯系，這些變化主要與哺乳動物大腦中的神經傳遞有關。其中，圖2H總結了與抑郁癥相關的主要代謝物和菌群功能（圖2）。

圖2. 代謝組學揭示抑郁評分相關血漿和糞便代謝物

血漿脯氨酸水平取決于腸道菌群組成和功能

由于飲食對腸道菌群組成和代謝活動有很大影響，采用食物頻率問卷對常規(guī)營養(yǎng)素、維生素、礦物質、氨基酸和脂肪酸與發(fā)現隊列（IRONMET）PHQ-9評分進行分析。結果顯示，脯氨酸是對抑郁癥影響最大的飲食因素。根據血漿脯氨酸和膳食脯氨酸水平將受試者分為4組：HPD-HPP（高膳食脯氨酸水平-高血漿脯氨酸水平），LPD-LPP（低膳食脯氨酸水平-低血液脯氨酸水平）、HPD-LPP、LPD-HPP。結果顯示，LPHQ-9評分從高到低依次為HPD-HPP、LPD-HPP、HPD-LPP、LPD-LPP。由于脯氨酸與抑郁癥的關聯最為一致，進一步分析了血漿脯氨酸與腸道菌群的關聯，結果表明，血漿脯氨酸水平與PHQ-9評分相關的菌群特征存在相關性。血漿脯氨酸與Parabacteroides和普雷沃氏菌屬呈正相關；與放線菌（包括雙歧桿菌）和毛螺菌科產SCFA菌呈負相關。與低血漿脯氨酸組（LPP）相比，高血漿脯氨酸組（HPP）Parabacteroides和Acidaminococcus的種水平較高，但雙歧桿菌屬和毛螺菌科水平較低，特別是Roseburia spp.。HPD-LPP組和HPD-HPP組具有不同的菌群組成，HPD-LPP組菌群組成與抑郁評分較低相關的菌群組成一致。功能上，HPD-LPP組在脯氨酸轉運和代謝上顯著富集，且與PHQ-9評分相關的菌群基因有關，這提示HPD-LPP組的腸道菌群增強脯氨酸的代謝和轉運，降低血液中脯氨酸水平，進而緩解抑郁。（圖3）。

圖3. 飲食和血漿脯氨酸與抑郁評分和腸道菌群有關

RNA測序揭示與高脯氨酸消耗有關的基因

由于膳食脯氨酸主要被小腸中的腸細胞代謝，對另一個獨立隊列（INTESTINE隊列，n=28）的空腸樣本進行RNA測序。差異基因表達分析結果表明，1,547個基因轉錄本與膳食脯氨酸有關。功能分析發(fā)現其參與GABA受體激活、突觸相互作用和軸突引導的通路，還參與細胞外基質(ECM)、肌肉收縮、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導和G蛋白偶聯受體（GPCR）信號傳導的通路（圖4）。

補充脯氨酸加劇小鼠抑郁樣行為

為了進一步研究膳食脯氨酸對抑郁癥的直接影響，采用小鼠模型進行驗證。給20只CD-1小鼠喂食標準飲食(SD)，其中補充脯氨酸(36g/L)或水（對照組）。在整個實驗過程中，小鼠長期暴露于不可預測的輕度壓力源（UCMS模型），在UCMS暴露6周后，實驗組之間的體重或飲用水無顯著差異。與補充水的對照小鼠相比，補充脯氨酸的小鼠血漿脯氨酸水平顯著升高。與只補充水且無壓力的對照小鼠相比，補充脯氨酸組在懸尾測試中不動時間更長，并蔗糖攝入量減少，這是抑郁癥的核心癥狀。此外，與對照組相比，UCMS+脯氨酸小鼠的血清脂多糖結合蛋白(LBP，細菌易位的標志物）水平更高，這表明菌群發(fā)生易位，并與人的結果一致（圖4）。

圖4. 膳食脯氨酸與空腸RNA有關

腦鐵沉積和全腦功能動力學揭示與抑郁癥和脯氨酸相關的rich-club網絡破壞

由于鐵在谷氨酸和GABA穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用，使用磁共振成像(MRI)評估IRONMET隊列患者大腦中鐵沉積情況。腦區(qū)松弛測量參數（AAL Atlas）和PHQ-9評分之間的相關性分析表明，扣帶和額葉相關區(qū)域的低鐵沉積與抑郁癥呈正相關。對驗證隊列（IMAGEOMICS）一部分患者(n=591)進行靜息狀態(tài)功能磁共振成像（fMRI）研究，并采用機器學習算法識別預測PHQ-9評分節(jié)點，共篩選出72個與抑郁癥相關的節(jié)點，68個與血漿脯氨酸水平相關的節(jié)點，其中30個與PHQ-9評分相關，且這些區(qū)域大多屬于rich-club區(qū)域（一組高度節(jié)點，它們之間連接更緊密）（圖5）。

圖5. 腦鐵沉積和腦網絡與抑郁評分和血漿脯氨酸相關研究

糞菌移植驗證抑郁與脯氨酸和GABA轉運有關

將來自20名不同PHQ-9評分的患者供體糞菌移植（FMT）到20只抗生素處理的小鼠中，采用恐懼條件誘導冷凍測試（一種公認的對壓力不適應反應模型）評估受體小鼠是否出現情緒受損。結果表明，供體的PHQ-9評分與受體小鼠的冷凍時間顯著相關。供體PHQ-9評分與受體小鼠菌群特征存在相關，該特征與人類抑郁癥相關的特征一致，與Acidaminococcus和普雷沃氏菌屬呈正相關，與放線菌門（尤其是雙歧桿菌和柯林斯菌）和產SCFA的毛螺菌科呈負相關。

考慮到菌群對谷氨酸能和GABA能的影響，對受體小鼠的內側前額葉皮層(mPFC)進行RNA測序，結果表明，在受體小鼠mPFC中確定了59個轉錄本與供體PHQ-9評分顯著相關；且44個轉錄本與受體小鼠冷凍時間相關，包括slc6a12、slc6a13和 slc6a20a。通路的過表征分析（ORA）表明，與供體PHQ-9評分負相關的50%轉錄本都聚集在一起，并與氧化磷酸化和神經退行性疾病有關。且鑒定出與PHQ-9評分相關基因簇，包含編碼GABA轉運蛋白（slc6a12和slc6a13）和脯氨酸轉運蛋白（slc6a20）的基因轉錄本，與功能分析結果一致。這些結果與代謝組、宏基因組結果一致，再次強調了TCA循環(huán)與GABA、谷氨酸代謝、以及脯氨酸-谷氨酸-GABA-菌群相互作用的重要性（圖6）。

圖6. 糞菌移植后情緒受損表型與mPFC轉錄水平相應改變

敲低脯氨酸/GABA轉運蛋白基因可抵御果蠅抑郁狀態(tài)

為了確定這些腦轉運蛋白在抑郁癥中的作用，連續(xù)5天（STAR方法）對黑腹果蠅進行12小時機械壓力重復刺激。結果顯示，與無壓力組相比，壓力組果蠅攀爬嘗試顯著減少，食欲降低，運動的總步行距離和速度降低，顯示自愿行為活動減少和整體缺乏動力，為抑郁常見癥狀。在果蠅神經元細胞中，敲低脯氨酸轉運蛋白CG43066（slc6a20同源體）后，壓力組與無壓力組在攀爬試驗、運動能力等行為實驗中無明顯差異，即壓力組不再表現出明顯的抑郁樣行為。敲低果蠅神經膠質細胞GABA轉運蛋白Gat（Slc6a12和Slc6a13同源體），也一定程度上改善壓力組的抑郁行為，表明神經膠質細胞中Gat對抑郁樣狀態(tài)具有保護作用（圖7）。

植物乳桿菌（L. plantarum）單菌定植可改善果蠅抑郁狀態(tài)

雖然Acidaminococcus和雙歧桿菌在人類和糞菌移植實驗中與抑郁癥最一致，但這兩個都不是果蠅菌群成員。因此，選擇了2種先前報道的果蠅菌群物種，且與抑郁癥呈負相關的植物乳桿菌（高GABA生產者）和陰溝腸桿菌（低GABA生產者）分別進行單菌定植。結果表明，在無菌和陰溝腸桿菌單菌定植雄性果蠅中觀察到攀爬動機顯著降低，但在植物乳桿菌單菌定殖中無改變。在無菌和定植陰溝腸桿菌應激的雌性果蠅中出現食欲不振，而定植植物乳桿菌后食欲不振則顯著改善。表明定植高GABA生產者植物乳桿菌對果蠅抑郁狀態(tài)具有保護作用（圖7）。

圖7. 敲低果蠅脯氨酸轉運蛋白和單菌定殖的保護作用

小結

本研究利用3個臨床隊列，結合代謝組、宏基因組、RNA測序等分析手段以及小鼠和果蠅模型，探究了腸道菌群、代謝物與抑郁癥的關系。揭示了依賴于腸道菌群的脯氨酸代謝變化對抑郁癥的影響，強調脯氨酸-谷氨酸-GABA-菌群互作在抑郁癥中的重要性，也提示靶向菌群或減少膳食脯氨酸或可有效改善抑郁。

參考文獻

Microbiota alterations in proline metabolism impact depression. Cell Metabolism. 2022.

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