高效的人群檢測，對主動監(jiān)控諸如SARS-CoV-2 這樣的病原體的傳播是非常重要的，在降低傳播方面提供了定量數(shù)據(jù)來支持決策者。在疫情開始的時候，COVID-19 幾乎毫無例外地使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)（RT-PCR）方法來檢測，但是單純依賴一種技術(shù)是有明顯劣勢的。這種在世界范圍對RT-PCR 方法前所未有的需求，導(dǎo)致檢測和其他必要試劑的長期短缺，限制了檢測容量。

與基于PCR 的檢測相比，質(zhì)譜檢測顯著更加具有特異性，要求一個更寬的視角去處理不同的樣本基質(zhì)和儀器技術(shù)。因此，根特大學(xué)（Ghent University）的研究人員發(fā)起了一項基于Cov-MS聯(lián)盟協(xié)作方案，該聯(lián)盟已經(jīng)產(chǎn)生了一個通用的、廣泛適用的基于質(zhì)譜的分析方案，可以輕松地適應(yīng)廣泛可變的測試設(shè)施環(huán)境。
 

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研究者隨后成立了一個協(xié)作聯(lián)盟(MS-Cov)，由15 個學(xué)術(shù)科研和工業(yè)實驗室組成，SCIEX等業(yè)界主要質(zhì)譜供應(yīng)商也在列。研究者利用SCIEX TripleTOF™ 6600+ 系統(tǒng)上采用SWATH^®采集方法獲得的高分辨率質(zhì)譜儀器數(shù)據(jù)，創(chuàng)建了一個獨立于質(zhì)譜儀器供應(yīng)商的Skyline文檔，其中17個肽段生物標(biāo)志物來自公開數(shù)據(jù)中檢測到的兩個SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白，即重組核衣殼蛋白(NCAP_SARS2)和刺突蛋白(SPIKE_SARS2)。向該聯(lián)盟的所有成員提供了Skyline文件，以及包含重組NCAP和SPIKE蛋白的樣品試劑盒，以及陰性患者背景下的稀釋系列。15個實驗室共享來自4個不同儀器供應(yīng)商的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)被集中收集，并用于供應(yīng)商獨立的免費軟件(Skyline)，以評估候選特征肽的最終整體方案性能和適用性，我們建立了Cov-MS數(shù)字孵化器，開放的交流和數(shù)據(jù)共享將有助于將該分析方案轉(zhuǎn)化為全球不同的臨床環(huán)境。所有補充數(shù)據(jù)均可在Cov-MS數(shù)字孵化器中獲得。
    圖3. Cov-MS聯(lián)盟報告(紅色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。(A) 優(yōu)化樣品制備。比較不同的樣本保存培養(yǎng)基、三氯乙酸(TCA)沉淀和15分鐘的消化酶解(n = 5)。LogSumAUC的增加表示為對數(shù)轉(zhuǎn)換。主要集中在三個優(yōu)化方面：應(yīng)用不同的酸沉淀策略，即用三氯乙酸(TCA)和鹽酸(HCl)，將消化酶解時間縮短到15分鐘，以及使用不同的保存培養(yǎng)基。雖然這些改變可以提高整體的信號(圖3)，但最好的策略還是通過相關(guān)多肽的MRM方法優(yōu)化和消除離子抑制或通過降低基質(zhì)干擾以及實驗條件更好。現(xiàn)在可以實現(xiàn)一個少于30分鐘的完整樣品制備工作流程。

(B)不同樣品制備耗材的比較。在標(biāo)準(zhǔn)的工作流程中，肽段在水中溶解并轉(zhuǎn)移到彈簧內(nèi)襯管(SI)樣品瓶。使用全回收(QR)小瓶，并在溶劑中加入5%的乙腈(ACN)，可以提高溶劑中大部分肽段的信號，但在UTM中沒有信號提升。底部的欄顯示估計的整體增益歸因于消耗品。
  圖3. Cov-MS聯(lián)盟報告(紅色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。 (C)增加eSwab樣品的樣本載樣量。由于eSwabs使用生理鹽水作為保存液，增加柱上樣品的量可能是有益的。因此，我們評估了將載樣量增加5倍的影響，無論是否使用SPE。整體平均LogSumAUC增加2.3倍(虛線)，比如，信號增加了5倍，如果將樣本分成5份，采用SPE策略 。也就是說，如果將5次50 μL的消化液濃縮到一個SPE柱上，至少可以相當(dāng)于兩個Ct值。自動化處理將使這一發(fā)現(xiàn)得到鞏固和擴展，但是我們在這里提醒可能會有SPE過載現(xiàn)象。由于缺乏內(nèi)部自動化處理方案，我們繼續(xù)采用原來的操作過程，50 μL樣品量和10 μL柱上進樣時，不應(yīng)采用SPE前處理。
  圖3. Cov-MS聯(lián)盟報告(紅色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。(D) Cov-MS聯(lián)盟內(nèi)的數(shù)據(jù)采集。為了簡化所有這些并行實驗方案，研究者為聯(lián)盟成員提供了詳細(xì)的方法優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)、包含17個肽段(145 個MRM)的Skyline模板和Cov-MS試劑盒。這些試劑盒含有重組核衣殼蛋白NCAP和刺突蛋白SPIKE的消化液，以及來自健康供體的UTM背景的稀釋液體，一式三份。重要的是，研究表明只有新一代串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀器，能夠達(dá)到足夠的靈敏度。此外，匯編數(shù)據(jù)結(jié)果證實了最初的假設(shè)，所選肽段是具有實驗特異性的。這些初步結(jié)果表明，不同的供應(yīng)商可以從不同的目標(biāo)肽段中通過疊加提高靈敏度，即使是相同的MRM。一個突出的例子是RGEPQTQGNFGDQELIR肽，它在SCIEX儀器上特別有效，可能是因為相應(yīng)的離子源更適合于多電荷的多肽。
 
研究者詳細(xì)描述了Cov-MS聯(lián)盟為建立一個穩(wěn)定、靈敏的正交試驗來診確認(rèn)SARS-CoV-2陽性所做的努力。為了能夠跟蹤每天進行的數(shù)百萬次RT-PCR檢測并與之保持一致，科學(xué)界的集體努力至關(guān)重要，這不僅僅是因為MRM檢測以前很少被用于檢測病毒。   圖5. MRM能力的預(yù)測。(A)理論上將Ct與MRM測定方法相關(guān)聯(lián)的絕對量。在完美的條件下(即質(zhì)粒)，用內(nèi)部RT-PCR檢測10 μL樣品中的10個基因組，Ct值為38；在Ct值為40時，檢測2.5個基因組。假設(shè)每個病毒粒子攜帶300-350個核衣殼蛋白(NCAP)分子，可以很容易地計算出10 μL中NCAP分子的絕對數(shù)量。表中突出顯示的部分 (C) Ct和MRM檢測之間潛在的實際相關(guān)性。通過增加32倍的上樣量，富集目標(biāo)可以產(chǎn)生5倍 Ct值的靈敏度。臨床RT-PCR預(yù)期比質(zhì)粒更高，MRM信號可能因為病毒樣顆粒(VLPs)而更高，這一事實映證這一點。
 
基于液質(zhì)工作流程的一個主要缺點是，數(shù)據(jù)采集不能在單個儀器上并行進行，而RT-PCR檢測使用多孔板。然而，使用8分鐘的梯度，一種儀器可以每天測量超過150名患者，通過多通道液相方案，這可以增加到每天500名患者。Cov-MS聯(lián)盟的一名成員(Alderley analytics)還研究了2分鐘梯度的應(yīng)用，并表明當(dāng)基質(zhì)相對干凈時，才可行，在沒有并行方案的情況下，每臺儀器每天可增加樣本檢測通量至600名患者。如我們的初步結(jié)果所示，在穩(wěn)定同位素標(biāo)記和抗肽段抗體俘獲 (SISCAPA)等預(yù)先免疫富集的情況下，可以達(dá)到低至1分鐘的梯度。至少從樣品制備的角度來看，沒有理由不能使用機器人自動化操作，就像RT-PCR制備一樣。

最近有一項突破性的技術(shù)，可以進一步提高產(chǎn)量，那就是聲波激發(fā)質(zhì)譜(AEMS)。SCIEX Echo™ MS系統(tǒng)，納升液滴以每秒三個樣本的速率從樣品中噴射到儀器中，每個液滴可測量4個MRM離子對。這可能會預(yù)期每臺儀器每天采樣約30000名患者。

下一期，COVID-19 檢測3」，我們將介紹SCIEX 使用聲波激發(fā)質(zhì)譜開發(fā)的肽段定量方法的研究進展。

如果，希望了解更多關(guān)于COVID-19質(zhì)譜檢測方法，SCIEX SWATH® 采集策略，SCIEX Echo™ MS系統(tǒng)，可以掃碼留下您的問題，我們的產(chǎn)品專家會與您溝通。  
參考文獻(xiàn)與信息

1. Cov-MS: A Community-Based Template Assay for Mass-Spectrometry-Based Protein Detection in SARS-CoV-2 Patients, JACS Au Article ASAP (2021); DOI: 10.1021/jacsau.1c00048

2. 獲取有關(guān)比利時根特大學(xué)的藥物生物技術(shù)實驗室的更多信息，請訪問
https://www.ugent.be/fw/pharmaceutics/pharmbiotech/en

3. 您可以在MedRXiv 上了解更多關(guān)于這個檢測的更多信息，希望獲得 Cov-MS 數(shù)據(jù)孵化器，請發(fā)送申請郵件至 covms@ugent.be

4. 獲取有關(guān)SCIEX TripleTOF™ 系統(tǒng)基于SWATH® 采集策略的更多信息， 請訪問https://sciex.com.cn/technology/swath-acquisition

5. 獲取有關(guān)SCIEX Echo™ MS系統(tǒng)的更多信息，請訪問
https://sciex.com.cn/products/integrated-solutions/Echo-ms