基因編輯技術(shù)CRISPR的應(yīng)用新進(jìn)展與挑戰(zhàn)
從2013年首次宣布CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以應(yīng)用于哺乳動(dòng)物開(kāi)始，CRISPR技術(shù)因其高效率、易操作和低成本，正在基因編輯領(lǐng)域掀起一場(chǎng)新的革命。2015年，張峰首次在NatureMedicine上撰文并總結(jié)了CRISPR臨床轉(zhuǎn)化所面臨的的三個(gè)挑戰(zhàn)，即基因編輯效率、特異性和遞送手段。經(jīng)過(guò)五年發(fā)展，2020年JenniferA.Doudna在Nature中的文章針對(duì)這三個(gè)挑戰(zhàn)提出相應(yīng)的解決方案，盡管CRISPR系統(tǒng)目前在臨床轉(zhuǎn)化中仍面臨多樣的技術(shù)瓶頸技術(shù)，但其在臨床一期實(shí)驗(yàn)中對(duì)遺傳性淀粉樣蛋白疾�。╤ATTR）的成功治療表明CRISPR系統(tǒng)依然具有光明的應(yīng)用前景。本文將從基因編輯效率、特異性和遞送手段三個(gè)方面闡述近幾年CRISPR系統(tǒng)的進(jìn)展。
基因編輯的有效性
CRISPR/Cas9發(fā)現(xiàn)之初只能用于雙鏈DNA編輯。2017年,張峰實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)Cas13a和Cas13b可在引導(dǎo)RNA(sgRNA)的作用下對(duì)RNA進(jìn)行切割,此后更多的Cas13家族成員如Cas13d、Cas13X和Cas13Y被發(fā)現(xiàn)，拓展了RNA編輯中編輯工具的選擇范圍。除了靶向雙鏈DNA和RNA外，JenniferA.Doudna還發(fā)現(xiàn)了一種新的Cas14蛋白，它可以不需要PAM序列而對(duì)單鏈DNA進(jìn)行非特異性切割，基于此特性該蛋白已成功應(yīng)用于病毒核酸檢測(cè)。
基于CRISPR/Cas切割活性的第一代CRISPR編輯系統(tǒng)主要依賴(lài)于細(xì)胞中非同源末端連接(NHEJ)機(jī)制介導(dǎo)基因敲除或依賴(lài)于同源重組修復(fù)（HDR）機(jī)制介導(dǎo)基因敲入。盡管CRISPR系統(tǒng)可通過(guò)HDR介導(dǎo)基因敲入，但由于HDR僅在G2和S期細(xì)胞中活性較高，因此，對(duì)于細(xì)胞分裂緩慢或處于有絲分裂后期的細(xì)胞，如神經(jīng)元，基于HDR策略的基因敲入并不適用；另外，HDR介導(dǎo)的基因組編輯方法是依賴(lài)Cas9在目標(biāo)位點(diǎn)引入雙鏈DNA斷裂和糾正模板來(lái)恢復(fù)基因功能，然而雙鏈DNA斷裂一旦形成，DNA損傷很容易通過(guò)NHEJ途徑而不是HDR進(jìn)行修復(fù)。因此，上述兩種因素導(dǎo)致HDR介導(dǎo)的基因修復(fù)效率較低，在體內(nèi)僅達(dá)到0.1%-6.5%的編輯效率。由于第一代CRISPR編輯系統(tǒng)在基因改造如基因點(diǎn)突變、基因片段插入的效率較低，因此其主要應(yīng)用與基因敲除實(shí)驗(yàn)，并以完成一個(gè)臨床一期試驗(yàn)及多個(gè)研究者發(fā)起的臨床研究（InvestigatorInitialed Trial，IIT）。
盡管目前CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠通過(guò)引入框外突變而有效地敲除靶基因，但在進(jìn)行基因缺失研究時(shí)必須注意基因補(bǔ)償反應(yīng)(genetic compensation response, GCR)。事實(shí)上，通過(guò)CRISPR敲除一個(gè)基因有時(shí)并沒(méi)有表現(xiàn)出應(yīng)有的表型差異，而利用RNA干擾手段敲低同一基因卻有可能產(chǎn)生明顯表型。這種差異是由于利用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除某一基因，但同時(shí)導(dǎo)致同一家族中其他成員基因表達(dá)上調(diào)所致。2019年，兩個(gè)研究小組證實(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除某一基因產(chǎn)生的短核苷酸序列突變可導(dǎo)致該基因其他同家族成員啟動(dòng)子區(qū)域表觀遺傳學(xué)修飾改變，并促進(jìn)該基因其他家族成員的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而補(bǔ)償原有基因敲除所誘發(fā)的表型改變。該機(jī)制的發(fā)現(xiàn)有助于解釋以往基于CRISPR/Cas系統(tǒng)建立的基因敲除模型中一些意想不到的表型結(jié)果。
2016年和2017年,劉如謙實(shí)驗(yàn)室分別將胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶與Cas9結(jié)合從而開(kāi)創(chuàng)性地建立了第二代基因編輯系統(tǒng)-堿基編輯器(BE)。該系統(tǒng)包含胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和鳥(niǎo)嘌呤編輯器（GBE）可以在不需要模板DNA和雙鏈DNA斷裂的情況下分別實(shí)現(xiàn)C·T、A·G和C·G核苷酸之間的轉(zhuǎn)化。除了在DNA中進(jìn)行基因編輯，張峰實(shí)驗(yàn)室還開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于Cas13的REPAIR系統(tǒng)，在RNA水平上實(shí)現(xiàn)腺苷A→肌苷I（鳥(niǎo)苷G）置換；魏文勝課題組則通過(guò)建立LEAPER系統(tǒng)，利用特殊設(shè)計(jì)的RNA（ADAR-recruitingRNA,arRNA）招募細(xì)胞中內(nèi)源脫氨酶ADAR，實(shí)現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA中腺苷A→肌苷I（鳥(niǎo)苷G）轉(zhuǎn)換；由于上述兩種RNA堿基編輯不依賴(lài)內(nèi)源性修復(fù)途徑。因此，即使在有絲分裂后期的細(xì)胞，如神經(jīng)元，REPAIR和LEAPER系統(tǒng)也同樣能夠介導(dǎo)有效的RNA編輯。與DNA編輯相反，RNA編輯是短暫的，更容易逆轉(zhuǎn)，允許對(duì)編輯結(jié)果進(jìn)行暫時(shí)控制。由于堿基編輯器的DNA和RNA靶向是由單一sgRNA主導(dǎo)的，因此，通過(guò)轉(zhuǎn)染多個(gè)sgRNA就有可能并行地進(jìn)行多個(gè)基因突變。然而，與之對(duì)比，利用HDR同時(shí)引入多個(gè)基因突變是非常困難的，即使在分裂細(xì)胞中效率也極低，實(shí)用性較差。最新的C·T、A·G和C·G堿基編輯器的基因點(diǎn)突變置換效率可分別達(dá)到~50%、~57%和~15%。基于目前的堿基編輯技術(shù)原則上可以治療超過(guò)70%的人單基因遺傳病。
胞苷堿基編輯器可將C轉(zhuǎn)換為T(mén)，腺嘌呤堿基編輯器可將A轉(zhuǎn)換為G，鳥(niǎo)嘌呤編輯器可將C轉(zhuǎn)換G。但是還有9種其它類(lèi)型的核苷酸變化：如T轉(zhuǎn)換為A和A轉(zhuǎn)換為T(mén)，是這三種堿基編輯器無(wú)法完成的操作；另外，堿基編輯器也無(wú)法實(shí)現(xiàn)堿基片段的插入和刪除。2019年劉如謙課題組開(kāi)發(fā)了先導(dǎo)編輯器，通過(guò)將nickaseCas9蛋白與逆轉(zhuǎn)錄酶形成復(fù)合物，在向?qū)NA的引導(dǎo)下，該復(fù)合物可以在特定DNA區(qū)域添加、改變、或者移除目標(biāo)核苷酸，也可實(shí)現(xiàn)所有12種單核苷酸轉(zhuǎn)換，插入最長(zhǎng)為44個(gè)核苷酸的新DNA序列，或刪除長(zhǎng)達(dá)80個(gè)堿基對(duì)的序列。之后該課題組在2021年進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DNA錯(cuò)配修復(fù)(MMR）途徑可強(qiáng)烈抑制先導(dǎo)編輯效率，并通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)顯性負(fù)相關(guān)MMR蛋白(MLH1dn)，使其達(dá)到了30%~50%的編輯效率。先導(dǎo)基因編輯技術(shù)原則上可以治療超過(guò)89%的人類(lèi)遺傳病。
除細(xì)胞核內(nèi)基因組突變外，線粒體基因組由母系遺傳，其突變可導(dǎo)致包括萊伯遺傳性視神經(jīng)病變和線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作等多種人類(lèi)遺傳病，因此開(kāi)發(fā)針對(duì)線粒體的基因編輯具有重要意義。然而，由于向?qū)NA無(wú)法穿過(guò)線粒體膜，因此CRISPR-Cas平臺(tái)不適用于編輯線粒體中的這類(lèi)突變。2020年和2022年劉如謙和Jin-SooKim課題組通過(guò)分別將胞苷脫氨基酶DddA和腺嘌呤脫氫酶TadA8e和特異的DNA序列結(jié)合蛋白TALE構(gòu)建形成融合蛋白，開(kāi)發(fā)了線粒體胞嘧啶堿基編輯器（DdCBE）和線粒體腺苷酸堿基編輯器（TALED）。由于DdCBE和TALED可分別實(shí)現(xiàn)C到T，和A到G的轉(zhuǎn)化，原則上可以校正>53%的已知線粒體突變位點(diǎn)。
基因編輯的特異性
雖然CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯方面比ZFN和TALEN表現(xiàn)出更高的保真度，但在生物學(xué)或臨床應(yīng)用中其脫靶效應(yīng)仍是一個(gè)主要問(wèn)題。CRISPR/Cas9編輯技術(shù)保真性的提高可通過(guò)優(yōu)化重組Cas9蛋白和改造sgRNA序列實(shí)現(xiàn)。例如，新的Cas9變異體如EvoCas9、HypaCas9、Cas9-HF、eSpCas9和SniperCas9，表現(xiàn)為較低的脫靶性，盡管與野生型Cas9相比，它們的在靶活性會(huì)降低。傳統(tǒng)的sgRNA序列包含與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的20個(gè)核苷酸，然而研究人員發(fā)現(xiàn)，使用截短的sgRNA，如17或18核苷酸長(zhǎng)度，可以將一些脫靶位點(diǎn)的發(fā)生率降低5000倍之多，而不犧牲目標(biāo)基因組編輯效率。除了縮短sgRNA的長(zhǎng)度，D.DewranKocak發(fā)現(xiàn)在sgRNA的5'端添加一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以提高Cas9和其他Cas效應(yīng)蛋白的特異性，平均提高55倍。除了提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的精度，其他Cas效應(yīng)蛋白也可被用于真核細(xì)胞的基因編輯，并展現(xiàn)出比Cas9更高的特異性。例如，Cas12a和Cas12b作為與Cas9在細(xì)胞切割活性相似的新型編輯蛋白，其對(duì)sgRNA和目標(biāo)DNA之間的單核苷酸錯(cuò)配具有很高的敏感性，因此，與CRISPR-Cas9工具相比，它們減少了脫靶效應(yīng)。
堿基編輯器自2016年首次報(bào)道以來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。然而，在2019年，堿基編輯工具的安全性受到了廣泛質(zhì)疑，先是楊輝等研究組報(bào)道了胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴(yán)重的DNA脫靶，接著KeithJoung團(tuán)隊(duì)、劉如謙團(tuán)隊(duì)和楊輝團(tuán)隊(duì)又分別報(bào)道了胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器存在大量的RNA脫靶效應(yīng)，其RNA脫靶效應(yīng)主要由堿基編輯器中和Cas9蛋白偶聯(lián)的胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶與RNA的偏好性結(jié)合導(dǎo)致。其中DNA水平的脫靶效應(yīng)可分為Cas依賴(lài)型和Cas非依賴(lài)型脫靶。Cas依賴(lài)型脫靶在ABEs和CBEs均有發(fā)生，可通過(guò)使用高特異性的Cas蛋白及突變體、截短型sgRNA而優(yōu)化。Cas非依賴(lài)型脫靶源自脫氨基酶與細(xì)胞內(nèi)基因組中瞬時(shí)存在的單鏈DNA的相互作用，主要發(fā)生在CBEs系統(tǒng)中。目前研究者主要通過(guò)構(gòu)建脫氨基酶突變體和不同類(lèi)型的脫氨基酶篩選對(duì)此加以優(yōu)化。由于CBEs和ABEs系統(tǒng)中的脫氨基酶多可作用于RNA的堿基發(fā)揮脫氨基作用，早期開(kāi)發(fā)的單堿基編輯器多在RNA水平存在明顯的脫靶效應(yīng)。目前研究者多通過(guò)蛋白質(zhì)工程構(gòu)建脫氨基酶的突變體以降低其在RNA水平的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。
先導(dǎo)編輯目前研究發(fā)現(xiàn)其基因編輯精準(zhǔn)度較高，只會(huì)產(chǎn)生少量的pegRNA依賴(lài)性的脫靶突變，進(jìn)一步通過(guò)全基因組和全轉(zhuǎn)錄組水平研究發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)編輯器不會(huì)導(dǎo)致pegRNA非依賴(lài)性脫靶突變，證明了先導(dǎo)編輯的安全性。
盡管TALED編輯技術(shù)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，也不會(huì)引起mtDNA的不穩(wěn)定和細(xì)胞核DNA中的脫靶效應(yīng)；但DdCBE編輯技術(shù)中，DdCBE可進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致其在核基因組上產(chǎn)生了嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。
CRISPR系統(tǒng)的遞送方法
CRISPR系統(tǒng)體內(nèi)遞送是實(shí)現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，目前有三種主要的傳遞策略，包括基于質(zhì)粒的遞送、CasmRNA和sgRNA的遞送以及Cas蛋白和sgRNA的直接傳遞(表1)。
表1CRISPR系統(tǒng)不同遞送方法匯總
基于質(zhì)粒的CRISPR遞送系統(tǒng),目前最廣泛的使用工具是腺相關(guān)病毒（AAV），AAV具有低免疫原性、感染效率高和無(wú)人致病性等特點(diǎn),其最大包裝長(zhǎng)度為4.7kb的基因片段。編碼SpCas9蛋白的mRNA大小約為4.3 kb，加上啟動(dòng)子和多聚腺苷化信號(hào)等其他必需序列，所需元件長(zhǎng)度已達(dá)4.7 kb，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)將Cas9和sgRNA構(gòu)建到同一AAV載體中。一種解決方案是使用雙AAV系統(tǒng)，將編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA分別裝入兩個(gè)AAV載體中。另一種方法使用較小尺寸的Cas蛋白。對(duì)于DNA編輯，CasX和CasMINI來(lái)源于非致病微生物，其編碼序列長(zhǎng)度分別約為2.9kb和1.5kb，具有特異的DNA切割特性，可成為潛在的Cas9替代蛋白。在RNA編輯方面，Cas13d編碼序列大小為2.8kb，比Cas13a、Cas13b等其他Cas13家族成員小，同樣也易于AAV包裝。
近年來(lái)，細(xì)胞外泌體已成為新的CRISPR系統(tǒng)遞送方法。紅細(xì)胞無(wú)基因組DNA，且外泌體分泌數(shù)量較高，另外，來(lái)自健康獻(xiàn)血者的O型血缺乏表面抗原，因此O型血來(lái)源的外泌體具有較低的免疫源性；Cas9mRNA和sgRNA可通過(guò)電穿孔方法導(dǎo)入純化的外泌體中。Cas9核酸酶與sgRNA形成的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體可以穿過(guò)細(xì)胞核進(jìn)行基因編輯，因此與轉(zhuǎn)染CRISPR質(zhì)�；騧RNA相比，Cas蛋白直接遞送具有作用速度快、免疫源低等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。另外近年來(lái)病毒樣顆粒作為潛在的基因藥物遞送載體也備受關(guān)注，張峰、劉如謙和蔡宇伽課題組相繼開(kāi)發(fā)了用于CRISPR系統(tǒng)遞送的SEND、VLP和mLP平臺(tái)；由于病毒樣顆粒缺乏病毒的遺傳物質(zhì)，它們可能比其他使用病毒的遞送方法更安全。
盡管CRISPR系統(tǒng)能夠通過(guò)不同的策略被遞送到細(xì)胞中，但其持續(xù)表達(dá)可能帶來(lái)由于脫靶導(dǎo)致的毒副作用。例如，Cas9可在非靶點(diǎn)位置引起大片段刪除和染色質(zhì)破碎；Cas9切割雙鏈DNA可引發(fā)p53介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，在基因編輯完成后，應(yīng)抑制CRISPR系統(tǒng)活性，以避免脫靶和毒性作用。幸運(yùn)的是，一些抗Cas蛋白如AcrIIA4、AcrIIC1和AcrIIC3以及硫代修飾的DNA寡核苷酸已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，它們能夠通過(guò)不同的機(jī)制抑制Cas9或Cas12a的在靶活性，因此，在臨床應(yīng)用中這兩種抑制劑都可作為潛在的CRISPR系統(tǒng)解毒劑。
結(jié)論
CRISPR技術(shù)的快速發(fā)展大大提高了我們對(duì)真核細(xì)胞基因組進(jìn)行精確編輯的能力。雖然基因編輯技術(shù)目前仍然面臨脫靶性和遞送效率偏低等多種問(wèn)題，但相信上述問(wèn)題將在未來(lái)的跨學(xué)科整合和科學(xué)家的合作中逐步得到解決。基因編輯技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化研究將推動(dòng)個(gè)性化醫(yī)療的快速發(fā)展。
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