實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)中的基本概念：

在整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)基線期，指數(shù)期，線性期和平臺(tái)期。其中在基線期和指數(shù)增長(zhǎng)期，擴(kuò)增產(chǎn)物都是以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，但是在基線期我們沒(méi)辦法檢測(cè)；而到了線性期和平臺(tái)期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴(kuò)增效率差別很大，因此沒(méi)有辦法計(jì)算模板的含量。因此，在指數(shù)增長(zhǎng)期的CT值就成了計(jì)算模板含量的關(guān)鍵值。

▲ 圖一：線性圖譜
 

▲ 圖二：對(duì)數(shù)圖譜
 

為什么知道CT值就能夠得到最初的目標(biāo)基因含量呢？

如圖三，表示一個(gè)基因單次擴(kuò)增曲線。N為擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)，模板的分子數(shù)乘以1+擴(kuò)增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說(shuō)，如果擴(kuò)增效率為100%，產(chǎn)物的分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是在線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，擴(kuò)增效率不可能是100%，因此PCR理論方程只在指數(shù)期成立，也就是圖三綠色框的部分。

▲ 圖三
 

數(shù)據(jù)處理：

以下三張圖分別表示我們?cè)谧鰺晒舛�量PCR時(shí)提到的三個(gè)名稱(chēng)：擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線。

1、絕對(duì)定量：使用一系列稀釋的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣本同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與起始模板量之間的線性比例關(guān)系。

注意事項(xiàng)：

☑  標(biāo)準(zhǔn)品必須來(lái)源可靠，濃度已知。

☑  標(biāo)準(zhǔn)品要和待測(cè)樣品同時(shí)在儀器中擴(kuò)增。

☑  只能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品覆蓋的濃度范圍進(jìn)行待測(cè)樣本濃度的推測(cè)。

2、相對(duì)定量：是用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣品之間的表達(dá)差異或目標(biāo)在不同時(shí)相差的表達(dá)差異，也就是倍數(shù)差異。

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