文獻解讀：cfDNA TAPS技術為早期癌癥檢測提供多模態(tài)信息
宋春嘯博士，2013年獲得美國芝加哥大學博士學位。2013年至2016年與美國斯坦福大學進行博士后研究。2016年起在英國牛津大學盧德維格癌癥研究所任研究組長。
2019年宋春嘯和他的科研伙伴Benjamin Schuster-Boeckler在Nature Biotechnology發(fā)表文章，報道了一種新的DNA甲基化測序方法TAPS技術，并從2019年4月到2021年9月陸續(xù)發(fā)表6篇TAPS技術相關高水平文章，內容覆蓋TAPS在長讀長測序的優(yōu)勢、不同表觀遺傳修飾的常見類型檢測、甲基化及羥甲基化與BS方法對比等方面分析其方法的優(yōu)勢及可用性。
今天講述的這篇文章主要是通過肝癌和胰腺癌構建甲基化模型證明TAPS方法的可行性。
文獻背景：
①目前癌癥的相關研究為治療癌癥提供了新方法，但早發(fā)現仍是治療癌癥的最佳機會。早期治療不僅大大提高了患者的生存率，而且還大大降低了成本。然而現有檢測方法還不能滿足這一需求。循環(huán)細胞游離DNA(cfDNA)——血漿中游離的DNA，來源于各種健康和病變組織中的死亡細胞——在開發(fā)早期癌癥檢測方法方面具有巨大的潛力。
②cfDNA中的遺傳信息（如突變和拷貝數變異(CNVs)）在監(jiān)測癌癥進展和治療方面具有潛在的實用價值。然而，考慮到早期疾病中腫瘤ctDNA的比例較低，基因變異的檢測具有挑戰(zhàn)性。此外，基因突變對確定惡性腫瘤來源位置所需的起源組織的信息不足。相反，廣泛的表觀遺傳變化，如癌細胞和腫瘤微環(huán)境的DNA甲基化，發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期。最近的研究表明，cfDNA甲基化是早期最有前途的癌癥的生物標志物之一，它提供了數千種甲基化變化，可以結合起來克服檢測限制和組織來源信息，從而允許高度可信的癌癥定位。
③DNA甲基化通過全基因組、堿基分辨率和定量測序方法來確定，如亞硫酸氫鹽測序。然而，亞硫酸氫鹽測序對DNA損傷較為嚴重，且數據匹配率低測序成本昂貴，因此目前的cfDNA甲基化測序受到低深度、靶向或低分辨率和定性富集的測序的限制，因此不能完全捕獲cfDNA甲基化組。
技術背景：
01 Bisulfite seq：
優(yōu)勢：甲基化樣本前處理金標準，樣本轉化率高達99.5%，應用此技術繪制甲基化圖譜（生長發(fā)育，腫瘤，復雜疾病等）
缺點：使用重亞硫酸鹽處理，會導致樣本損傷，被裂解成小于1.5kb的片段，部分區(qū)域會發(fā)生丟失；樣本中C-T的轉化降低了樣本的復雜性，導致樣本測序質量低，唯一匹配率較低（如圖1）。
02 EM-seq：
優(yōu)勢：與金標準對比結果一致，轉化率98-99%，使用酶法轉化，反應溫和，不會造成片段的損傷；數據質量較高，保留了原始樣本的情況。
缺點：樣本中C-T的轉化降低了樣本的復雜性，轉化過程需兩步完成，轉化效率受實驗員操作影響較大。
TAPS（宋春嘯團隊開發(fā)）：與金標準對比結果一致，使用酶法轉化5mC-T（占比4%）等，反應溫和，不會造成片段的損傷，片段可到10kb；樣本復雜程度高，數據質量較高，唯一匹配率高，降低測序成本，且保留了原始樣本的情況，可與其他變異做聯合檢測。
▲圖源：Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution
實驗設計：本文優(yōu)化了cfDNA的TAPS(cfTAPS)，以僅從10ng的cfDNA中提供高質量和高深度的全基因組甲基化組，實驗共計使用87例樣本，其中2例樣本轉化效率低于85%，未計入后續(xù)分析樣本情況，85個樣本（HCC：21，PDAC：23，Control：30，胰腺炎：7，肝硬化：4，）的平均5mC轉化率為97.0%。證明了來自cfTAPS的豐富信息能夠整合差異甲基化、組織來源和片段譜的多模態(tài)表觀遺傳和遺傳分析，從而準確區(qū)分HCC和PDAC患者和癌前炎癥患者的cfDNA樣本。
實驗結果：
☞cfTAPS測序的適應
如圖2：本圖A,B展示了實驗流程及轉化原理，圖C展示了87個cfDNA TAPS文庫中的總reads、唯一匹配和去重唯一匹配數據占總數據比例的比較。圖D基于已知位置有修飾或未修飾胞嘧啶的85個cfDNA TAPS文庫的5mC轉化率和假陽性率�；谖葱揎棓U增子峰值估計的假陽性率(未修飾C的轉化率)為0.28%，證實了cfTAPS可以對cfDNA中5mC的高靈敏度和特異性檢測。
☞來自cfTAPS的全基因組DNA甲基化
樣本：52%的PDAC和67%的HCC患者處于I期和II期，對比了癌癥和對照樣本中 cfDNA 的全基因組甲基化比例。對照樣本中的平均 CpG 甲基化水平與癌癥 cfDNA 中相近，肝癌中僅很少的樣本cfDNA發(fā)生整體低甲基化；對HCC和PDAC進行主成分分析，可以部分的和對照區(qū)分開；對HCC的主成分2相關性最高的前200個位點注釋，發(fā)現富集在增強子上；對PDAC的主成分1相關性最高的前200個位點注釋，發(fā)現富集在啟動子上。
☞來自cfTAPS的差異DNA甲基化
基于HCC和對照中差異甲基化增強子的模型分類性能的ROC曲線和基于PDAC和對照之間差異甲基化啟動子的模型分類性能的ROC曲線分別得到LOO癌癥預測分數，此預測分數可將肝硬化的3例（共4例）和胰腺炎的6例（共7例）也與癌區(qū)分開。
☞cfTAPS組織的來源模型
文章整理了來自144個公開可獲得的組織和血細胞WGBS的cpg水平的甲基化數據，并將其分為32種生理上不同的組織和血細胞類型，包括肝腫瘤組織�？紤]到增強子區(qū)域中組織特異性DNA甲基化的普遍存在，我們構建了一個增強子聚集的組織甲基化參考圖譜，通過執(zhí)行非負最小二乘回歸 (NNLS) 計算了 cfTAPS 樣本中的組織貢獻。我們觀察到單獨 HCC 中肝臟腫瘤的貢獻顯著增加和 PDAC 樣本中記憶 T 細胞的貢獻顯著增加。cfTAPS為早期癌癥檢測提供了有價值的組織來源信息。
☞cfTAPS片段化模型
用cfTAPS檢測到的cfDNA片段化模式與全基因組測序 (WGS)產生的cfDNA片段化模式一致，主峰位于167bp，次峰位于320 bp，并且低于 167 bp 的較小峰具有10 bp的周期性，反映了核小體斷裂模式。同controls相比，癌癥患者有較高比例的<150bp片段和較低比例的310-500bp片段。進一步證實cfTAPS保存了cfDNA的片段信息。
文章中開發(fā)了一種使用cfTAPS表征cfDNA片段化譜的新方法，但是與基于甲基化的模型相比，基于片段的模型不能很好地將肝硬化或者胰腺炎從癌癥中區(qū)分開，說明片段攜帶的癌癥特異信息較少。
☞使用cfTAPS進行多癌檢測
為了進一步提升多癌種檢測的性能，構建一個結合差異甲基化、組織溯源、片段模式三種特征的混合模型，聯合模型的總體準確性（準確分類）達到0.86（64/74），區(qū)分癌和非癌的準確性0.92（68/74），突出多模態(tài)信息用于癌癥類型預測的好處。
研究結論:
使用低起始量10ng的cfDNA構建甲基化文庫，并應用于肝癌胰腺癌，有很好的表現，與cfDNA WGBS相比的優(yōu)勢在本研究中做了展示：①降低樣本投入量，②得到更高的數據質量，③更全的甲基化位點模型，④更多遺傳信息的保留；通過cfTAPS實現的深度測序，得到cfDNA甲基化和gDNA甲基化差異區(qū)，發(fā)現甲基化生物標志物的早期癌癥檢測。
在本研究中，從cfTAPS中提取CNVs和片段信息，后者在cfDNA WGBS中丟失。進一步證明了一種結合差異甲基化、組織起源和片段譜的綜合方法可以提高多子檢測的模型性能。
局限性:
二、由于有限的公開全基因組組織甲基化數據(例如，沒有PDAC組織數據可用)，比較依賴數據WGBS數據庫，現在的研究遠沒有開發(fā)出cfTAPS的組織起源信息的全部潛力。
