活細(xì)胞成像是指主要用于捕獲活體、活動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞圖像的技術(shù)，無(wú)論是作為單獨(dú)的靜態(tài)圖片還是作為延時(shí)系列。相應(yīng)地，活細(xì)胞成像的技術(shù)應(yīng)用大致可以分為兩類(lèi)：
1.細(xì)胞在自然、存活狀態(tài)下的圖像記錄
2.實(shí)時(shí)觀察和記錄細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體的動(dòng)態(tài)過(guò)程

活細(xì)胞成像的用途 
采用活細(xì)胞成像的研究一直在上升，這主要是由于部分在熒光標(biāo)記技術(shù)，電子數(shù)據(jù)處理和光學(xué)技術(shù)的進(jìn)步。

1960 年代初期綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)以及自 1990 年代以來(lái)其許多衍生物的廣泛使用標(biāo)志著顯微鏡新時(shí)代的開(kāi)始。熒光蛋白的使用，無(wú)論是單獨(dú)使用還是在產(chǎn)生融合版本的熒光團(tuán)之后，都可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞和細(xì)胞成分，同時(shí)可用的蛋白質(zhì)和酶靶標(biāo)的數(shù)量不斷增加。

事實(shí)證明，在細(xì)胞生物學(xué)和使用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的領(lǐng)域向前邁出的非常重要的一步是在細(xì)胞的存活狀態(tài)下可視化細(xì)胞的能力�；罴�(xì)胞與非活細(xì)胞的區(qū)別不僅與生命過(guò)程中發(fā)生的變化有關(guān)，也與死亡過(guò)程中發(fā)生的變化有關(guān)。生命是結(jié)構(gòu)的涌現(xiàn)屬性，生命過(guò)程的停止總是與結(jié)構(gòu)的某些變化有關(guān)，無(wú)論因果順序如何。也就是說(shuō)，無(wú)論生命的終止是特定結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果，還是變化是終止的結(jié)果，變化總是存在的。

普通的電子顯微鏡雖然有著較高的分辨率但卻無(wú)法可視化活細(xì)胞動(dòng)態(tài)。而活細(xì)胞成像技術(shù)可以有效地記錄細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體中發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程。比如細(xì)胞成像儀可以清晰地拍攝到細(xì)胞分裂過(guò)程以及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)化，被 標(biāo)記特定細(xì)胞器的熒光標(biāo)記物以及光譜行為的變化也能在細(xì)胞成像儀下被記錄。

活細(xì)胞成像的重要考慮因素
在使用活細(xì)胞成像時(shí)，研究人員必須始終牢記，要使該技術(shù)取得成功并產(chǎn)生盡可能準(zhǔn)確地反映活細(xì)胞狀態(tài)的可用結(jié)果，需要滿(mǎn)足許多條件。細(xì)胞。這些包括：正確的培養(yǎng)條件。與任何其他組織培養(yǎng)一樣，活細(xì)胞成像需要使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基（包括緩沖液和生長(zhǎng)血清）、適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器和無(wú)菌技術(shù)。溫度必須恒定在 37°C。此外，為了抵消代謝產(chǎn)物引起的酸化并保持 pH 值 7.4，使用了碳酸氫鹽 (HCO 3 – ) 和溶解的二氧化碳 (CO 2 )的緩沖系統(tǒng)，并將適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)器提供的氣體連接到顯微鏡培養(yǎng)箱. 如果沒(méi)有 CO 2如果可用，也可以使用含有 10–20 mM HEPES 的緩沖液。

培養(yǎng)基中的酚紅是監(jiān)測(cè) pH 值的常用方法。培養(yǎng)容器的選擇也很重要。細(xì)胞通常在塑料上生長(zhǎng)得更好，但玻璃在高倍率下可提供更高的光學(xué)質(zhì)量。另一方面，玻璃通常需要用諸如聚 -L-賴(lài)氨酸或聚-L-鳥(niǎo)氨酸之類(lèi)的基材涂覆。細(xì)菌污染始終是一個(gè)問(wèn)題，因此幾乎總是使用抗生素。如果特定方案要求避免使用抗生素，則培養(yǎng)物的制備和維護(hù)過(guò)程中的護(hù)理變得更加重要。

保護(hù)細(xì)胞免受光毒性。由于光毒性，使用熒光成像可能對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生潛在的有害影響，光毒性可能來(lái)自不同的來(lái)源。細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)分子如卟啉、黃素等能吸收光，與氧反應(yīng)降解，釋放出超氧自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫等活性氧，對(duì)細(xì)胞造成損傷。熒光染料本身也會(huì)產(chǎn)生自由基，因?yàn)樗鼈冊(cè)谔幱诩ぐl(fā)態(tài)時(shí)會(huì)與氧氣發(fā)生反應(yīng)�？梢酝ㄟ^(guò)實(shí)施一些簡(jiǎn)單但有效的措施來(lái)避免光毒性。這包括：
(1) 使用具有較低能量（較長(zhǎng)波長(zhǎng)）激發(fā)光譜的熒光團(tuán)，
(2) 使用盡可能低的光強(qiáng)度和盡可能短的激發(fā)持續(xù)時(shí)間，適當(dāng)?shù)膸�率。在觀察不斷變化的事件時(shí)，調(diào)查員需要確保圖像幀速率適合跟蹤這些事件。太低的幀速率意味著時(shí)間分辨率的損失和記錄文件中感興趣的過(guò)程的較差表示。另一方面，過(guò)高的幀速率會(huì)增加光毒性的風(fēng)險(xiǎn)并導(dǎo)致生成更大的文件。

但是，如果要記錄的事件的速度如此之高以至于所需的幀速率導(dǎo)致光毒性怎么辦？在這種情況下，必須降低激發(fā)光強(qiáng)度—— 但這會(huì)導(dǎo)致圖像變暗。可以增加相機(jī)的增益以補(bǔ)償?shù)凸�，但這意味著噪聲水平也會(huì)增加，從而降低圖像的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。增加相機(jī)靈敏度，為了在較低的激發(fā)光強(qiáng)度和較低的增益下使用所需的幀速率獲得令人滿(mǎn)意的結(jié)果，在這種情況下比較有幫助的。



高速顯微鏡儀器的重要性
活細(xì)胞成像用于記錄各種事件，并且在制作延時(shí)序列時(shí)，幀速率必須適當(dāng)。例如，在記錄細(xì)胞分裂時(shí)，事件可能在幾分鐘內(nèi)發(fā)生，如在一些果蠅胚胎中，或在 24 小時(shí)內(nèi)發(fā)生，如在快速分裂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。當(dāng)然，有些細(xì)胞需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能分裂，但這些與我們無(wú)關(guān)。在所有這些例子中，低幀率 ——每幾秒甚至每幾分鐘一次——就足夠了。在光譜的另一端，有非常快的事件，例如與細(xì)胞通訊相關(guān)的事件（即動(dòng)作電位觸發(fā)和細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)事件）。使用適當(dāng)?shù)臅r(shí)間分辨率可以精確計(jì)時(shí)現(xiàn)象及其在多細(xì)胞神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生的級(jí)聯(lián)事件中的位置。電生理膜片鉗等技術(shù)可以在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)非常高的分辨率，但在觀察網(wǎng)絡(luò)時(shí)用途有限，因?yàn)橹荒芡瑫r(shí)監(jiān)測(cè)少數(shù)細(xì)胞。此外，它們的侵入性可能會(huì)損害觀察中的現(xiàn)象。使用成像方法時(shí)不存在這些缺點(diǎn)。

有不同的方法可以通過(guò)不同的設(shè)置實(shí)現(xiàn)快速成像。共聚焦顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)較高的幀速率，共振掃描儀可以達(dá)到幾十赫茲，但代價(jià)是空間分辨率。旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)共焦系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)更高的幀速率，在幾百赫茲的水平上，同時(shí)也會(huì)犧牲一些空間分辨率，主要是在 Z 軸上。

當(dāng)需要較大時(shí)間分辨率時(shí)，就要選用寬場(chǎng)顯微鏡。靈敏度是高速顯微鏡相機(jī)最重要的特性，因?yàn)楦哽`敏度相機(jī)將能夠在困難條件下以較大幀的速率運(yùn)行，同時(shí)仍能提供令人滿(mǎn)意的結(jié)果。高速相機(jī)的核心是傳感器， CMOS類(lèi)型的傳感器可以獲得較大的靈敏度。

總而言之，活細(xì)胞成像具有廣泛的應(yīng)用，但也向研究人員提出了一組特殊的要求，這些要求在對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行成像時(shí)是不存在的。

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