背景
01-5-氟尿嘧啶硅納米片(5-Fu-Si NSs)的合成與表征
圖1. a) 5-Fu-Si NSs的TEM圖像。b) Si NSs晶格的TEM圖像。c)直徑分布和5-Fu-Si NSs。d) 5-Fu-Si NSs的Zeta勢。e)分散在水中的5-Fu-Si NSs TEM-EDS成像。f)直徑分布5-Fu-Si NPs分散在含有10% FBS和RPMI的PBS DMEM培養(yǎng)基中24 h. g10%胎牛血清和RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。h)分散于水和PBS中的5-Fu-Si NSs的直徑分布。i)直徑分布Si和5-Fu-Si NSs在PBS中分散7天。j)分散在水中的Si NSs TEM-EDS成像。k) 5-Fu-Si nsss的FT-IR光譜。l)累積5-Fu和5-Fu- si nsss在pH 7.4、6.5和5.0下在37°C下的釋放。
02-體外藥物裝載和釋放行為
此外,Si NSs 具有高比表面積的二維片狀結(jié)構(gòu)。 Si NSs 的物理特性使其具有很強的負載能力。這對藥品的包裝和運輸非常有幫助。因此,選擇 Fu 作為藥物模型來評估 Si NSs 的負載能力。通過將 Fu 與 Si NSs 混合,F(xiàn)u 通過弱相互作用力吸附到 Si 表面,根據(jù)公式(1)計算出的負載容量(LC)為 30.03%。優(yōu)異的給藥能力將有利于腫瘤區(qū)域釋放更多的藥物,對進一步的化療起到至關(guān)重要的作用?紤]到腫瘤組織的特性具有低酸度和較高的氧化還原電位,藥物遞送系統(tǒng)必須在腫瘤環(huán)境中保持有效。
03-5-Fu-Si NSs 的細胞毒性和熱化療分析
接下來,在進一步研究生物醫(yī)學應(yīng)用之前,納米材料的低毒性是其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。首先通過 MTT 測定評估 Si NSs 的細胞毒性。 U87-MG 細胞的活力保持在 94.27 ± 6.1% 以上,顯示出良好的生物相容性,即使 Si NSs 的濃度達到 200 µg mL-1(圖 2a)。 然而,在與相同濃度的 5-Fu-Si NSs 孵育 24 小時后,細胞活力下降到 67.45 ± 3.3%。 這些結(jié)果顯示了化療中有效的腫瘤細胞殺傷能力,接下來,在進一步研究生物醫(yī)學應(yīng)用之前,納米材料的低毒性是其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。首先通過 MTT 測定評估 Si NSs 的細胞毒性。 U87-MG 細胞的活力保持在 94.27 ± 6.1% 以上,顯示出良好的生物相容性,即使 Si NSs 的濃度達到 200 µg mL-1(圖 2a)。 然而,在與相同濃度的 5-Fu-Si NSs 孵育 24 小時后,細胞活力下降到 67.45 ± 3.3%。 這些結(jié)果顯示了化療中有效的腫瘤細胞殺傷能力,這是濃度依賴性的(圖2a)。 5-Fu是一種臨床抗癌藥物,對癌細胞有很好的殺傷作用。
圖2. a) Si NSs和5-Fu-Si NSs作用于U87-MG細胞12 h后的細胞活力呈濃度依賴性。b) Si NSs +激光和5-Fu-Si NSs +激光處理U87-MG細胞12 h后,濃度為依賴的細胞活力。c) Calcein-AM(綠色,活細胞)和PI(紅色,死細胞)染色U87-MG細胞的熒光圖像,評價5-Fu-Si nsss不同處理的熱化療效果。
04-光聲和光熱效應(yīng)的體外評價
基于上面顯示的 5-Fu-Si NSs 的光吸收和低毒性,我們進一步評估了 5-Fu-Si NSs 作為造影劑增強 PA 成像和同時作為光敏PTT劑殺死腫瘤。如圖 3a、b 所示,PA 信號強度與 5-Fu-Si NSs 濃度呈正相關(guān),顯示出強烈的濃度依賴性。為了進一步評價5-Fu-Si NSs在體內(nèi)的腫瘤光熱效應(yīng),與去離子水(對照組)相比,5-Fu-Si NSs組250 µg mL-1的溫度從28.01迅速升高到5 分鐘內(nèi)達到 46.56 °C,照射 10 分鐘后達到最高溫度 50.10 °C(圖 3c)。分別研究了不同濃度 5-Fu-Si NSs(25、50、100、250 和 500 µg mL-1)在 808 nm 激光照射(1.0 W cm-2)下的光熱圖像(圖3d)。此外,我們還研究了在 808 nm 波長下激光照射 (1.0 W cm-2) 后 5-FuSi NSs (18.75 µg mL-1) 中 5-Fu 的釋放。隨著激光照射時間的增加,一些 5-Fu 從 5-Fu-Si NSs 中釋放出來。接下來,還研究了在不同激光功率照射下 5-Fu-Si NSs 的溫升效應(yīng)濃度為 250 µg mL-1(圖 3e)。這些發(fā)現(xiàn)表明 5-Fu-Si NSs 具有出色的 PTT 能力。其溫升效應(yīng)與激光功率呈正相關(guān)。隨后,還研究了 5-FuSi NSs 的光熱穩(wěn)定性。如圖 3f 所示,經(jīng)過 5 次加熱/冷卻循環(huán)后,光熱轉(zhuǎn)換行為甚至沒有變化。這些結(jié)果表明,5-Fu-Si NSs 在激光照射前后具有出色的光熱穩(wěn)定性。此外,計算出的光熱轉(zhuǎn)換效率可以達到45.8%,遠高于先前報道的結(jié)果。[40,41] 這些結(jié)果表明 5-Fu-Si NSs 可以用作潛在的 PTT 劑。
05-PA成像和光熱效應(yīng)的體內(nèi)評估
在體外PA造影劑和PTT劑驗證提示下,我們繼續(xù)開展體內(nèi)實驗研究。如圖 4a(頂行)和圖 4b 所示,PA 信號是在給藥前 0 小時獲得的。 然后,靜脈注射后腫瘤區(qū)域的PA信號顯著逐漸增加。 分別在 2、5、8、12 和 24 小時將 Si NSs(50 mg kg-1)注射到 U87-MG 腫瘤模型中。 從圖 4a 中三排的 5-Fu-Si NSs (50 mg kg-1) 也觀察到相同的現(xiàn)象。如圖 4b 所示,隨著時間的延長,腫瘤區(qū)域的 PA 信號強度逐漸增加。5-Fu-Si NSs 和 Si NSs 的 PA 信號分別在注射 5 小時和 8 小時后達到峰值。值得注意的是,如圖 4b 所示,注射 5 小時后,5-Fu-Si NSs 的 PA 信號強度高于 Si NSs。 并且,5-Fu-Si NSs 的峰值 PA 信號比將 5-Fu-Si NSs 注入相應(yīng)腫瘤區(qū)域之前的初始 PA 信號大 3.6 倍(圖 4b)。 此外,5 小時的 SaO2 峰值濃度比注入 5-Fu-Si NSs 前 SaO2 的初始濃度高 3.76 倍(圖 4c)。 還評估了不同時間點的 HbT,表明它具有改善脫氧環(huán)境的能力(圖 4d)這些結(jié)果充分證明了 Fu 修飾的 Si NSs 由于均勻分散和穩(wěn)定性而更快地到達腫瘤部位,并且還表明 EPR 效應(yīng)增強了滲透性和保留。 5-Fu-Si NSs 可以顯著增強腫瘤切片中的 PA 信號強度,這是由于血管豐富,血管壁空間寬,結(jié)構(gòu)完整性差,無淋巴回流。注射24小時后仍觀察到腫瘤區(qū)域PA信號的增強,表明5-Fu-Si NSs在體內(nèi)相對較長的循環(huán)時間可能與Fu分子的表面修飾有關(guān)。注射Si NSs和5-Fu-Si NSs后,還提供了不同時間點(0、5和24小時)腫瘤區(qū)域PA信號強度和SaO2的3D分布(圖4e)。體外生物學分布表明,5-Fu-Si NSs 可以在 24 小時后在大多數(shù)組織中減少和清除(圖 S5,支持信息)。在確認了 5-Fu-Si NSs 在體內(nèi)腫瘤中的蓄積作用后,我們隨后評估了 5-Fu-Si NSs 在體內(nèi)的熱化學治療效果。帶有 U87-MG 腫瘤的小鼠在靜脈注射后暴露于 808 nm 激光(1.5 W cm-2)5 小時。通過紅外熱成像監(jiān)測腫瘤區(qū)域的溫度變化。 5-Fu-SiNSs組腫瘤區(qū)溫度在5分鐘內(nèi)迅速升高12℃,顯示出良好的PTT效果,而PBS對照組幾乎沒有升溫效應(yīng)。相反,由于麻醉下的生理原因,溫度略有下降(圖 4f,g)。總體而言,這些結(jié)果表明 5-Fu-Si NSs 是一種用于腫瘤診斷和治療的有前途的生物相容性熱化學治療試劑。
06-OCTA/LS 成像對微血管變化的體內(nèi)跟蹤和評估
微血管是輸送營養(yǎng)物質(zhì)和清除組織中廢物的唯一通道。特別是,它在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。 鑒于此,為了研究腫瘤早期生長和熱化療過程中的腫瘤血管生成和微血管形態(tài)學變化,我們對帶有 U87-MG 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 BALB/c 裸鼠進行了背部皮膚窗口,用于長期 OCTA 和 LS 成像(圖 5a)。 圖 5b 顯示了代表性的白光、OCTA 和 LS 圖像(從左到右列),它們是從一個對照組 (PBS) 和兩個實驗組(5-Fu-Si NSs 和 5-Fu-Si NSs plus)收集的 激光)共 13 天。隨著腫瘤的生長,在用PBS處理之前,對照組中腫瘤區(qū)域的微血管(用白色虛線標記)從中心到邊緣逐漸縮。▓D5c)。 并且,基于這種現(xiàn)象,腫瘤中心區(qū)域的 RBF 也降低了(圖 5f)。腫瘤內(nèi)血管塌陷可能是由于癌細胞在相對狹窄的空間內(nèi)快速增殖所致。在第七天,PBS 溶液是 i.v.注射到荷瘤裸鼠體內(nèi)作為對照組。之后,腫瘤ROI內(nèi)的血管保持了較低的MVD和RBF的特征。另一方面,隨著腫瘤組織的快速生長,腫瘤細胞會分泌大量的血管內(nèi)皮生長因子,促使新生血管形成,為腫瘤細胞提供足夠的氧氣和營養(yǎng),以供腫瘤細胞繁殖。]如 LS 圖像所示。圖 5b 中的對照組,隨著腫瘤的生長,腫瘤周圍的供血網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,原有血管的新生血管形成,其中 LS 圖像中的血管被顏色編碼以表示來自紅色的 RBF(較高) 到藍色(下)。此外,與腫瘤生長早期(0-3天)相比,生長后期(9-13天)腫瘤區(qū)域周圍的RBF相對增加,以維持腫瘤細胞的生長。對于用 5-Fu-Si NSs 治療的實驗組,在實體瘤中心,我們還觀察到與對照組相似的微血管變化,包括較低的 MVD 和 RBF(圖 5d,g),在靜脈注射之前。注入 5-Fu-Si NSs。 隨后,靜脈注射后注射 5-Fu-Si NSs(7-13 天),在腫瘤的 ROI 中,我們觀察到幾個新血管,MVD 和 RBF 略有增加(圖 5d,g)。 這些結(jié)果表明,作為單一化療方法,5-Fu-Si NSs在一定程度上抑制了腫瘤細胞的快速生長,相對減輕了實體瘤內(nèi)的組織壓力,使腫瘤內(nèi)的血管得以恢復(fù)。 . 此外,被腫瘤破壞的微血管網(wǎng)絡(luò)沒有完全恢復(fù),腫瘤周圍的RBF相對高于腫瘤早期,這意味著我們實驗過程中5-Fu-Si NSs并未完全清除腫瘤細胞。此外,我們監(jiān)測和評估了在熱化療策略(靜脈注射 5-Fu-Si NSs 加激光照射)下動物腫瘤模型的微血管變化。從圖5b中可以看出,在熱化療治療之前,實體瘤中心的原始血管結(jié)構(gòu)被破壞,導致ROI的RBF明顯下降(圖5h)。 此外,腫瘤區(qū)域內(nèi)的外圍含有致密的新血管(圖 5b),這導致 MVD 略有增加(圖 5e)。 熱化療后,腫瘤組織和受累血管均被清除。 更重要的是,腫瘤區(qū)域周圍的血管逐漸恢復(fù),為修復(fù)受損組織提供氧氣和營養(yǎng)(9-13天)。
圖5. a) 5-Fu-Si NSs小鼠模型、治療及監(jiān)測方案示意圖。b)各組不同時間點有代表性的白光、OCTA、LS圖像。白色虛線代表腫瘤區(qū)域和ROI區(qū)域。c) PBS處理定量血管總密度。d) Si NSs處理量化總血管密度。e) 5-Fu-Si NSs加激光照射定量血管總密度。f) PBS治療RBF定量。g)用Si NSs處理定量RBF。h) 5-Fu-Si NSs加激光照射定量RBF。標尺:2毫米。
07-體內(nèi)藥代動力學
由于表面氟尿嘧啶修飾提高了生物相容性,5-Fu-Si NSs 可能比 Si NSs 具有更長的循環(huán)壽命。為了進一步驗證這一點,通過靜脈注射探索了體內(nèi)藥代動力學。 向 SD 大鼠注射 Si NSs 和 5-Fu-Si NSs。如圖 6g 所示,在 SD 大鼠中,5-Fu-Si NSs 的血漿濃度隨時間衰減比 Si NSs 慢得多。這些結(jié)果進一步證實了5-Fu-Si NSs在血液中的循環(huán)壽命更長,并且比Si NSs具有更好的藥物特性,這將有利于增強5-Fu-Si NSs在腫瘤部位的富集和滲透性。
08-熱化學療法的體內(nèi)抗腫瘤活性
上述研究證實了 5-Fu-Si NSs 的體外治療效果,進一步證明 5-Fu-Si NSs 優(yōu)越的蓄積性和滲透性可以實現(xiàn)體內(nèi)增強的抗腫瘤活性和協(xié)同熱化療,U87-MG 腫瘤將荷瘤裸鼠隨機分為以下六組:1) PBS, 2) PBS 加激光, 3) Si NSs, 4) Si NSs 加激光, 5) 5-Fu-Si NSs, 6) 5-Fu -Si NSs 加激光。如圖6a-d所示,5-Fu-Si NSs對腫瘤生長有抑制作用,但作用不顯著。與此形成鮮明對比的是,5-Fu-Si NSs加激光對腫瘤生長具有更高的抑制作用。 Si NSs加激光組雖然有抑制作用,但由于缺乏化療藥物清除殘留腫瘤組織,消融一段時間后出現(xiàn)二次生長。值得注意的是,在治療期間,5-Fu-Si NSs荷瘤裸鼠的體重沒有顯著變化(圖6e),并且在連續(xù)隨訪期間沒有發(fā)現(xiàn)荷瘤裸鼠死亡在該組中(圖 6f)。