椎間盤中央膠質(zhì)樣部分髓核（NP）變性是椎間盤退變(IVDD)和腰背痛發(fā)生的主要原因。目前的治療方法僅限于緩解背部癥狀，這使得該病擁有極高的復(fù)發(fā)率。NP細胞(NPCs)是NP組織中分布的主要細胞類型，它們負責維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。NPCs增殖緩慢，缺乏自我再生能力，這增加了疾病治療的難處。目前對NPCs的病理生理學研究通常在轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組分析水平。然而，組織水平的分辨率掩蓋了細胞間和細胞類型內(nèi)改變的異質(zhì)性。

來自澳大利亞悉尼大學和昆士蘭大學以及來自河北醫(yī)科大學的研究人員在Advance Science（IF 16.8）雜志上發(fā)表了題為“Single-Cell Transcriptome Profiling Reveals Multicellular Ecosystem of Nucleus Pulposus during Degeneration Progression”的文章，該文章利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與IVDD發(fā)展相關(guān)的細胞類群以及這些細胞間的相互作用關(guān)系，揭示了NP中NPCs型的復(fù)雜性和表型特征，從而為IVDD治療提供了新的見解和線索。

研究材料
8例不同退化程度患者的脊柱髓核組織

技術(shù)路線
· 步驟1：單細胞轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建NPCs的單細胞圖譜；
· 步驟2：通過分化軌跡分析發(fā)現(xiàn)IVDD發(fā)展的關(guān)鍵NPCs細胞群；
· 步驟3：對免疫細胞群進行聚類分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵免疫類細胞群；
· 步驟4：通過細胞通訊分析結(jié)果構(gòu)建以NPCs細胞為核心的細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。

研究結(jié)果
1. 單細胞轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建NP組織的單細胞圖譜
作者分離了8名不同程度變性的IVDD患者的NP組織用于單細胞檢測，根據(jù)高表達基因和已發(fā)表的文章對NPCs進行鑒定注釋，共確定了6個細胞亞群。這表明NP細胞群具有較強的異質(zhì)性。接下來，作者分析了退化等級與細胞群類型之間的相關(guān)性。HT-CLNPs和regNPCs是II級椎間盤的主要細胞類型。effectNPCs和HT-CLNPs是III級和IV級椎間盤的主要細胞類型。對于V級椎間盤，fibroNPCs和adhesionNPCs是主要的細胞類型。此外，IVDD嚴重程度從II級到V級，伴有adhesionNPCs和fibroNPCs的比例增加，而homeostaticNPCs的比例則呈現(xiàn)相反的趨勢。而實驗結(jié)果也驗證了這一觀點。除此之外，通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)了 一組與退化程度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其中包括AR、REL、LMX1A和PRDM1都是首次發(fā)現(xiàn)。而基于IVDD分級相關(guān)的差異分析，作者發(fā)現(xiàn)了一組可能促進脊柱退性的信號通路，包括抗原加工和遞呈通路、TNF通路、MAPK通路和Hippo通路等。

圖1 人類NP組織細胞圖譜的鑒定以及與IVDD嚴重程度的相關(guān)性

2. 通過分化軌跡分析發(fā)現(xiàn)IVDD發(fā)展的關(guān)鍵NPCs細胞群
為了分析各亞群間的功能差異，對鑒定的NPCs亞群研究其生物學過程。EffectorNPCs高表達代謝相關(guān)基因（如類固醇生物合成、糖胺聚糖代謝等）。RegNPCs高表達細胞炎癥反應(yīng)和內(nèi)源性刺激反應(yīng)相關(guān)的基因（如CXCL3、IL-6和CHI3L1等）。homeostaticNPCs則高表達細胞穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因（如翻譯調(diào)節(jié)、蛋白/RNA代謝等）。AdhesionNPCs則顯著富集與細胞遷移和細胞基質(zhì)黏附相關(guān)的基因。此外，作者對這些不同的NPCs進行了分析，包括神經(jīng)分布、血管生成和細胞衰老等因素，這些都與IVDD發(fā)展相關(guān)。

接著，作者通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)這些細胞譜系的分化軌跡，順序依次為：fibroNPCs→AdhesionNPCs→EffectorNPCs→RegNPCs→HT-CLNPCs→homeostaticNPCs。通過RNA velocity分析發(fā)現(xiàn)了同樣的分化軌跡，并且分析了fibroNPCs中一些關(guān)鍵基因（如Col14A1、CoL12a1、CHAD、CRTAC1、TNC和Lamb1等）。這些結(jié)果說明fibroNPCs具有祖細胞的特征。隨后，作者通過相關(guān)分析和實驗驗證了這一結(jié)論，并指出在fibroNPCs未來的研究中可能是一個潛在的治療靶點。

圖2  單細胞揭示了NPCs的轉(zhuǎn)錄特征

圖3  分化軌跡分析揭示IVDD終末期的祖細胞類型

3. 對免疫細胞群進行聚類分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵免疫類細胞群
除NPCs外，NP組織中還發(fā)現(xiàn)了免疫細胞。根據(jù)基因表達水平對免疫細胞進行鑒定注釋。根據(jù)高表達基因和已發(fā)表的單細胞研究，確定了9個亞群。分別為NK細胞，巨噬細胞，單核細胞，T細胞，粒細胞巨噬細胞祖細胞（G-GMP），中性粒細胞，B細胞，漿細胞和粒細胞髓性抑制細胞（G-MDSC）。作者分析了退化等級與細胞群類型之間的相關(guān)性，相比輕度退化的NP組織，在嚴重退化的NP組織中G-MDSCs顯著減少。并且通過實驗，作者驗證了這一現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示了G-MDSCs的存在對于IVDD的發(fā)展具有保護作用。

圖4 單細胞揭示免疫類細胞的細胞圖譜

圖5  G-MDSCs的功能研究

4. 構(gòu)建以NPCs細胞為核心的細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型
由于上述的分析結(jié)果顯示NP組織由NPCs和免疫細胞組成。接下來，作者通過細胞通訊分析，對細胞間的相互作用關(guān)系進行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了免疫類細胞與NPCs類之間存在廣泛的作用關(guān)系。這些作用關(guān)系主要是通過細胞間的配體和受體進行，如VEGFA、VEGFB和VEGF受體（FLT1、ADRB2和NRP2等）。需要注意的是巨噬細胞和NPCs之間的相互作用關(guān)系可能與促進血管生成相關(guān)。而健康的IVD大部分是無血管的，顯示這種作用關(guān)系誘導(dǎo)的血管生成在IVDD的發(fā)展過程中扮有重要作用。除此之外，中性粒細胞和巨噬細胞表達生長因子，包括TGFβ、PDGF和OSM等，這些相關(guān)因子對于NPCs的增殖具有促進作用，這可能與NP內(nèi)環(huán)境中的免疫平衡、細胞增殖和血管生成相關(guān)。然而確切的分子機制還需要進一步的實驗來驗證。

圖6  免疫細胞與NPCs在IVDD中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

小編小結(jié)
作者通過單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了IVDD患者在退化過程中，NP組織中NPCs和免疫細胞的異質(zhì)性和表型，以及這些細胞在IVDD發(fā)展過程中的作用。發(fā)現(xiàn)了幾種與IVDD發(fā)展密切相關(guān)的細胞類型以及對應(yīng)的marker。并且通過細胞通訊分析構(gòu)建了IVDD中的細胞相互作用關(guān)系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為IVDD治療提供了新的見解和線索。

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