研究材料
8 周齡雄性 C57BL/6J 小鼠；MIN6 細(xì)胞；鎘暴露人群及正常人群尿液

技術(shù)路線
· 步驟1：動物模型證實(shí)鎘暴露在體內(nèi)和體外胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生功能障礙的關(guān)系；
· 步驟2：體外分析胰腺β細(xì)胞由鎘暴露引發(fā)的代謝物及mRNA擾動；
· 步驟3：鎘暴露人群尿液代謝組學(xué)分析；
· 步驟4：構(gòu)建鎘暴露擾動代謝網(wǎng)絡(luò)。

研究結(jié)果
1. 鎘暴露引發(fā)小鼠體內(nèi)葡萄糖代謝失衡
鎘暴露處理的小鼠出現(xiàn)了明顯葡萄糖代謝失調(diào)，血糖水平在第三周和第六周顯著增加。此外，在腹腔葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)中，鎘暴露小鼠也顯示出了血糖水平升高和血清胰島素水平降低的情況。對鎘暴露小鼠胰島進(jìn)行H&E染色和免疫熒光染色，觀察到胰島組織出現(xiàn)形態(tài)學(xué)損傷和β細(xì)胞明顯減少。

圖1 H&E染色和免疫熒光結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證鎘暴露是否在體外誘導(dǎo)胰腺 β 細(xì)胞功能障礙，在體外使用CdCl2 處理MIN6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力和胰島素分泌會受到CdCl2濃度和處理時(shí)間的影響。通過以上體內(nèi)和體外兩部分?jǐn)?shù)據(jù)表明鎘暴露會導(dǎo)致葡萄糖耐受不良、胰島受損并會抑制胰腺 β 細(xì)胞胰島素分泌。

2. MIN6細(xì)胞鎘暴露后出現(xiàn)整體代謝紊亂
對鎘暴露24小時(shí)后的MIN6細(xì)胞進(jìn)行LC-MS非靶向代謝組學(xué)檢測，多維統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組內(nèi)樣本聚集趨勢緊密，鎘暴露與正常MIN6細(xì)胞分離趨勢明顯，根據(jù)VIP>1，P value <0.05篩選出對差異影響較大的代謝物76種，主要類別是核苷、核苷酸和類似物、有機(jī)酸和衍生物、脂質(zhì)和類脂分子，這表明鎘暴露會導(dǎo)致 MIN6 細(xì)胞中的顯著代謝紊亂。

圖2 鎘暴露及正常MIN6細(xì)胞代謝組PCA及OPLS-DA分析

對差異代謝物進(jìn)行亞細(xì)胞分析，有28種代謝物位于線粒體中，主要是核苷、核苷酸和類似物、有機(jī)酸及衍生物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子。其中有7 種代謝物同時(shí)存在于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，6種代謝物同時(shí)存在線粒體和溶酶體中。線粒體、溶酶體和 ER 中共存在 4 種代謝物，表明這些細(xì)胞器在代謝上與毒性有關(guān)。此外，過氧化物酶體被認(rèn)為是脂質(zhì)和氧化還原信號網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵樞紐，而鎘暴露后過氧化物酶體和線粒體有9種代謝物同時(shí)存在，這表明細(xì)胞線粒體功能和氧化應(yīng)激可能會受到毒性的干擾。

3.鎘暴露毒性與線粒體功能受損有關(guān)
進(jìn)一步借助KEGG數(shù)據(jù)庫對代謝通路和功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10種脂毒性相關(guān)代謝物濃度伴隨鎘暴露升高，并與位于線粒體中的代謝物密切相關(guān)，這些結(jié)果也支持線粒體作為鎘暴露代謝毒性的主要靶細(xì)胞器。對MIN6 細(xì)胞和小鼠胰腺中調(diào)節(jié)線粒體 TCA 循環(huán)和相關(guān)脂肪酸氧化的基因的 mRNA 表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因表達(dá)均受到嚴(yán)重?cái)_動，表明鎘暴露通過失調(diào)基因表達(dá)損害線粒體 TCA 循環(huán)和相關(guān)的脂肪酸氧化。

圖3 TCA循環(huán)及脂肪酸氧化相關(guān)基因表達(dá)

4.鎘暴露人群與正常人群尿液樣本代謝組學(xué)分析
對比分析了15名高濃度鎘暴露工人和15名健康人的尿液樣本，共鑒定出53種差異代謝物（VIP>1,P value<0.05）,對排名前20的代謝物進(jìn)行ROC分析， AUC 值在 95% 置信區(qū)間內(nèi)介于 0.867 和 1 之間，表明這些代謝物具有良好的預(yù)測性能。對代謝物進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)多種代謝通路擾動同時(shí)存在于人尿和胰腺β細(xì)胞中，這些結(jié)果表明，鎘暴露對線粒體代謝的毒性可以通過尿液中的代謝物來指示。

5. 鎘暴露的代謝毒性及其影響機(jī)制
從尿液與胰腺β細(xì)胞中共存的擾動代謝物和糖尿病的代謝物標(biāo)志物進(jìn)行重疊，篩選出L-谷氨酰胺、硫胺素和�；撬徇@三種代謝物，進(jìn)行ROC分析，發(fā)現(xiàn)AUC值處于0.751-0.960之間。這些結(jié)果表明，在MIN6 細(xì)胞中鑒定出的擾動代謝物與人類接觸鎘的產(chǎn)生的代謝毒性密切相關(guān)，且鎘暴露使人群尿液中的糖尿病相關(guān)生物標(biāo)志物含量顯著上升。

圖4 糖尿病標(biāo)志物及鎘暴露擾動代謝物
 

6. 鎘暴露對 TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝影響的通路圖
根據(jù)細(xì)胞和人群中鑒定到的擾動代謝物數(shù)據(jù)和在 MIN6 細(xì)胞和小鼠胰腺中的驗(yàn)證結(jié)果，繪制出了鎘暴露對線粒體 TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝的影響通路圖。

圖5 鎘暴露對TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝影響的通路圖
 

小編小結(jié)
本文通過非靶向代謝組學(xué)在多層次上描繪了鎘暴露對機(jī)體代謝的影響，在亞細(xì)胞器水平上挖掘與描繪了鎘暴露的代謝毒性，并提出了尿液中相關(guān)代謝物的含量檢測可以作為檢測鎘暴露對機(jī)體代謝毒性的一種手段。這一工作首次揭示了鎘誘導(dǎo)的代謝紊亂在胰島β細(xì)胞功能障礙中的重要作用，強(qiáng)調(diào)了從人群水平控制鎘暴露降低糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的重要性。