一、背景

　　人膽囊癌細(xì)胞是從一位61歲的男性低分化膽囊癌患者中建立的；GBC-SD細(xì)胞的形狀有多邊形、紡錘形和正方形；GBC-SD細(xì)胞能分泌CEA和CA19-9。GBC-SD細(xì)胞倍增時(shí)間大約為21.4小時(shí)，可移植到裸鼠，生成的腫瘤與原發(fā)腫瘤相似。

　　二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

　　1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

　　1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　2、細(xì)胞處理：

　　1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在800-1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至6ml。

　　2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

　　1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

　　2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。

　　3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。

　　4.收到細(xì)胞后首次傳代將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:4的比例進(jìn)行。

　　3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

　　三、應(yīng)用

　　用于青蒿琥酯聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人膽囊癌細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究：

　　研究青蒿琥酯和5-FU對人膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡和細(xì)胞周期的影響,比較兩種藥物對細(xì)胞的作用強(qiáng)度,探究青蒿琥酯在治療膽囊癌中的應(yīng)用前景。

　　方法：用CCK-8法來檢測青蒿琥酯和5-FU的OD值并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值;使用EdU-488法和克隆形成實(shí)驗(yàn)用來測定青蒿琥酯和5-FU對細(xì)胞增殖的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯(lián)用對細(xì)胞遷移的影響;使用AnnexinV和PI雙標(biāo)法標(biāo)記細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯(lián)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況;使用PI單標(biāo)法標(biāo)記細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯(lián)用對細(xì)胞周期的影響情況。

　　結(jié)果：CCK-8法顯示選取48h的OD值數(shù)據(jù)計(jì)算得出的結(jié)果作為青蒿琥酯的IC50值,IC50=43.7μmol/L,5-FU的IC50=28.1μmol/L。在24h和48h觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi),與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組對細(xì)胞的增殖能力有抑制作用。EdU-488法顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合作用組對細(xì)胞的增殖有抑制作用。細(xì)胞劃痕的結(jié)果顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組對細(xì)胞的遷移能力有抑制作用。

　　AnnexinV和PI雙標(biāo)法檢測5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組對細(xì)胞的凋亡發(fā)生有明顯促進(jìn)作用。PI單標(biāo)法用來檢測細(xì)胞的細(xì)胞周期,5-FU組、青蒿琥酯組以及在兩藥聯(lián)合作用組時(shí)顯示與對照組相比,5-FU組、青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組能抑制細(xì)胞的S期和G2/M期。

　　結(jié)論：1、青蒿琥酯在體外可抑制GBC-SD膽囊癌細(xì)胞的增殖、凋亡;2、在體外實(shí)驗(yàn)中,青蒿琥酯和5-FU聯(lián)用較青蒿琥酯單用抗腫瘤的效果更好;3、在體外實(shí)驗(yàn)中,青蒿琥酯和5-FU聯(lián)用較5-FU單用抗腫瘤的效果更好;4、在體外實(shí)驗(yàn)中,青蒿琥酯抗腫瘤的效果弱于5-FU抗腫瘤的效果。