中喬新舟
 
做細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候，對(duì)于剛開始接觸細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)來說，最怕的就是細(xì)胞受污染。以下是細(xì)胞主要污染的八個(gè)源頭以及分辨細(xì)胞是否污染和防治一些細(xì)胞污染的方法，僅供參考。
細(xì)胞污染認(rèn)定：凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染，細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。細(xì)胞污染根據(jù)污染源主要可以分為物理性，化學(xué)性和生物性污染。
 
                                                   01細(xì)胞物理性污染預(yù)防措施
 
 
 
物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動(dòng)、輻射(紫外線或熒光)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變，如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長受抑制甚至細(xì)胞死亡。通過實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對(duì)細(xì)胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備，如離心機(jī)。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過冷的溫度對(duì)細(xì)胞的影響。
 
                                                      02化學(xué)性污染防治手法
 
 
培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染�；瘜W(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長。不同細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲(chǔ)存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對(duì)血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見的化學(xué)性污染。水是唯一一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時(shí)應(yīng)考慮到這個(gè)因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對(duì)水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水。需要注意的是，超純水放置過久其純度會(huì)下降。在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染，因?yàn)楦邏赫魵忮伡凹兯畽C(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度，我們應(yīng)采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。動(dòng)物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對(duì)不同細(xì)胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，最好選用同一批次的血清。培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑　培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對(duì)上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí)，正確配置和儲(chǔ)存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯(cuò)誤，混用類似化合物等錯(cuò)誤。培養(yǎng)器皿及容器　細(xì)胞培養(yǎng)過程中會(huì)使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小，構(gòu)形設(shè)計(jì)可能會(huì)影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細(xì)胞生長密度。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過程中的差異可能對(duì)培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲(chǔ)存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因?yàn)榫凭�、�?qiáng)酸、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。
 
                                                     03不可不預(yù)防的微生物污染
 
 
由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而在培養(yǎng)基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細(xì)胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無法挽救的。一般在細(xì)胞受到污染早期或污染較輕時(shí)，能及時(shí)處理并除去污染物，部分細(xì)胞還有可能得到挽救。但當(dāng)細(xì)胞持續(xù)在污染環(huán)境中生長時(shí)，輕者細(xì)胞生長緩慢，分裂相減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)，胞漿中出現(xiàn)較多的顆粒物質(zhì)；較重的細(xì)胞增殖停止，分裂相消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。不同的微生物污染物對(duì)細(xì)胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細(xì)菌增殖迅速，能在很短的時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。
 
                                                   04霉菌污染的防治秘訣
 
         
    此種污染表現(xiàn)：真菌的種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長。有時(shí)通過顯微鏡可能會(huì)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)瓶外壁生長的菌絲，較易誤認(rèn)為污染。發(fā)現(xiàn)瓶外的菌絲后應(yīng)及時(shí)用酒精擦拭干凈。
       處理：首先，需確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體，還是酵母�，F(xiàn)在你確認(rèn)是霉菌污染。因此，盡快把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，同時(shí)需要對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中所用的器材和試劑做處理。
      一般來說，高濃度的抗生素和抗霉菌素都可能對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞系有毒性作用，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。
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下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。
5)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6)重復(fù)步驟4。
7)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染
 

                                                    05預(yù)防細(xì)菌污染有妙招

       細(xì)菌污染較常見的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養(yǎng)液可預(yù)防和排除個(gè)別一般少量細(xì)菌的污染。一旦發(fā)生細(xì)菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短時(shí)間內(nèi)變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯渾濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以明確細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養(yǎng)基內(nèi)滴入少量培養(yǎng)液，37度培養(yǎng)以檢測(cè)。處理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48小時(shí)后再換常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)在早期污染時(shí)此法有效。細(xì)胞培養(yǎng)中用抗生素多為預(yù)防細(xì)菌污染，一半多聯(lián)合應(yīng)用。一旦發(fā)生污染后再使用抗生素常常難以根除，有的抗生素只有抑菌作用而無殺菌效應(yīng)。

 

 

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  06預(yù)防有道，支原體也會(huì)被打倒

 

        

  支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑0．2um)并獨(dú)立生活的微生物．約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。      支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)．其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。     支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6—8．0)，對(duì)酸耐受性差。對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。      支原體污染細(xì)胞后．培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁．多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解．因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢．甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

 

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為確定有無支原體污染可做如下檢酗：                                                                        

①相差顯微境檢測(cè)：將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察．支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。② 熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗．置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向細(xì)胞面滴加pH5．5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速．也可以利用透射電鏡。④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高．但方法較為復(fù)雜                                                                                               
處理                                                                                                                                          
（1）  加溫：根據(jù)支原體對(duì)熱敏感的特點(diǎn)，將受支原體污染的細(xì)胞放在41度作用4~5小時(shí)，最長不超過18小時(shí)，以殺滅支原體。但如此高的溫度對(duì)細(xì)胞生長本身也有影響，因而在實(shí)驗(yàn)前先用少量細(xì)胞膜所最適合的溫度和時(shí)間，以盡可能保證殺滅支原體而細(xì)胞本身又不受損傷。（2）  動(dòng)物體內(nèi)接種：將受支原體污染的細(xì)胞接種在同種動(dòng)物的皮下或腹腔，借體內(nèi)的免疫系統(tǒng)殺滅支原體。待一定時(shí)間后，取出做原代培養(yǎng)再繁殖。                                                                                               
 
    07怎樣殺滅黑膠蟲-細(xì)胞的災(zāi)星
 
     
  “黑膠蟲”在細(xì)胞培養(yǎng)中是一個(gè)令人頭痛的問題，盡管剛開始做細(xì)胞培養(yǎng)，但在自己培養(yǎng)的細(xì)胞中也出現(xiàn)過“小黑點(diǎn)”，在高倍鏡下似乎能看見其有不規(guī)則的運(yùn)動(dòng)，并且其生長與細(xì)胞的生長有此消彼長的關(guān)系，即當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)小黑點(diǎn)會(huì)相應(yīng)的減少；反之則增加，似乎有細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)生長的關(guān)系，但總的來說它的出現(xiàn)并不影響細(xì)胞的生長。細(xì)胞經(jīng)過每天換液，PBS沖洗，細(xì)胞中的小黑點(diǎn)逐漸減少，最終消失（在之后的換液傳代中，偶爾會(huì)在鏡下看見個(gè)別的小黑點(diǎn)）。在此過程中我們也看了一些關(guān)于“黑膠蟲”的資料，發(fā)現(xiàn)其實(shí)它是實(shí)驗(yàn)室中普遍存在的一個(gè)問題，國內(nèi)外對(duì)“黑膠蟲”并沒有一個(gè)明確的定義。其實(shí)更加偏向于不存在所謂的“黑膠蟲”問題。首先小黑點(diǎn)并不影響細(xì)胞的貼壁生長，這是與大部分微生物污染不同。其次，培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的小黑點(diǎn)只是狀態(tài)差的細(xì)胞發(fā)生死亡后形成的，可能是一個(gè)凋亡小體，也肯能是細(xì)胞碎片。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)，這些小黑點(diǎn)就會(huì)減少。第三，當(dāng)顆粒的直徑足夠小，在液體中作不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)也是正常的。                            
 
  08預(yù)防細(xì)胞的交叉污染守則
 
      
   細(xì)胞污染和細(xì)菌污染不同，細(xì)胞污染是由于在培養(yǎng)過程中各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒有微生物存在，但使培養(yǎng)細(xì)胞不同種類之間發(fā)生混亂，細(xì)胞生長特性，形態(tài)發(fā)生變化。有些變化輕微，不易察覺，有些則可能由于污染的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢(shì)而最終壓過原來細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞生長的抑制，最終死亡。污染過的細(xì)胞由于種類不純，無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。     防治及處理：（1）在進(jìn)行多個(gè)種類細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所有器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好作上標(biāo)記以區(qū)分。對(duì)每一種細(xì)胞按順序進(jìn)行操作，避免一起操作時(shí)造成的混亂。（2）進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器或滴管不要接觸培養(yǎng)瓶瓶口，避免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液瓶中。在進(jìn)行其他細(xì)胞操作時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞污染。（3）所有從別處轉(zhuǎn)來的或是自己所建的細(xì)胞系都要早期留有的充足的凍存儲(chǔ)備，一旦懷疑發(fā)生交叉污染，可做細(xì)胞遺傳學(xué)方面的鑒定，如發(fā)現(xiàn)原有的細(xì)胞遺傳物發(fā)生改變，可以復(fù)蘇早期凍存的細(xì)胞使用。