在大多數(shù)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞已經(jīng)成為鑒定其分化潛能的金標(biāo)準(zhǔn)。
 

前面我們已經(jīng)分享了成骨誘導(dǎo)分化、成脂誘導(dǎo)分化的操作，本期來(lái)到三系分化的最后一站——成軟骨誘導(dǎo)分化操作講解！

 

成軟骨誘導(dǎo)分化

軟骨的破壞、缺失是骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）在內(nèi)的多種骨科疾病的重要病理改變。由于軟骨特殊的解剖及組織特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修復(fù)能力異常不足，因此通過(guò)人工方法修復(fù)軟骨破壞具有重要臨床意義。

近年來(lái)，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的發(fā)現(xiàn)和研究深入，其來(lái)源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能、與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等優(yōu)良特性，使得其在軟骨修復(fù)應(yīng)用中具有令人期待的應(yīng)用潛力。

 

MSC成軟骨分化的過(guò)程：

MSC首先收回其突起，聚集成團(tuán)，這個(gè)團(tuán)中間的細(xì)胞經(jīng)分裂分化轉(zhuǎn)變成一種大而圓的細(xì)胞，即成軟骨細(xì)胞；成軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)和纖維（主要為II型膠原蛋白），當(dāng)基質(zhì)的量增加到一定程度時(shí)，成軟骨細(xì)胞被分隔在陷窩內(nèi)，分化為成熟的軟骨細(xì)胞。

 

體外誘導(dǎo)成軟骨分化的鑒定

主要是形態(tài)學(xué)觀察、阿利辛藍(lán)染色，以及檢測(cè)成軟骨的標(biāo)志物——II型膠原蛋白來(lái)進(jìn)行，包括通過(guò)免疫組化、Western Blot檢測(cè)II型膠原蛋白的表達(dá)，以及RT-PCR檢測(cè)II型膠原蛋白的mRNA的表達(dá)等不同的角度進(jìn)行鑒定；而阿利辛藍(lán)則主要檢測(cè)成軟骨細(xì)胞內(nèi)酸性粘多糖。

OriCell^® 間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化阿利辛藍(lán)染色效果

實(shí)操走起

所需材料

● OriCell^® 間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒（套裝內(nèi)含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、成軟骨誘導(dǎo)添加物、阿利辛藍(lán)染色液）

● 4%多聚甲醛溶液或10%福爾馬林溶液

 

實(shí)驗(yàn)操作步驟

1. 將3~4×10⁵個(gè)待誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，20℃，250×g離心4min。

2. 吸去上清。加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化預(yù)混液，重懸上一步離心所得沉淀，20℃，150×g 離心 5min。

3. 重復(fù)步驟2，再次清洗細(xì)胞。

4. OriCell^® 間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化添加物II（以下簡(jiǎn)稱(chēng)添加物II）的添加，按照比例（1mL成軟骨誘導(dǎo)分化預(yù)混液中加入10μL添加物II），吸取實(shí)驗(yàn)所需劑量的添加物II，加入相應(yīng)體積的預(yù)混液中配制成成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，輕柔吹打混勻。

5. 將步驟3所得細(xì)胞沉淀用0.5mL成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基重懸，20℃，150×g離心5 min。

6. 擰松離心管蓋以便于氣體交換。將其豎立放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7. 當(dāng)細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象時(shí)（一般為 24 h 或 48 h 后，視實(shí)際情況而定），輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。

8.自接種開(kāi)始計(jì)算，每隔2~3 d給細(xì)胞換用新鮮的成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，每管約0.5mL。

9.持續(xù)誘導(dǎo)，直至管內(nèi)形成直徑1.5~2 mm的軟骨球，即可準(zhǔn)備切片染色。

 

注意事項(xiàng)

1、吸取添加物II之前需短暫離心試劑管，使試劑聚集于管底以便取用。

2、務(wù)必將添加物II分裝保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融，可保存12個(gè)月。

3、加入添加物II的成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基務(wù)必現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃保存不可超過(guò)12h。

4、步驟6不需要吸去上清或重懸細(xì)胞；24h之內(nèi)不要晃動(dòng)離心管。

5、步驟8，每次更換培養(yǎng)基后，都需輕彈離心管，使軟骨球脫離管底懸浮在液體中；且更換培養(yǎng)基后務(wù)必?cái)Q松離心管蓋再放入培養(yǎng)箱中。

 

軟骨球切片染色操作步驟

注意：本步驟以石蠟切片染色為例。若使用冰凍切片，請(qǐng)遵照切片機(jī)使用規(guī)程。

1. 固定。誘導(dǎo)形成的軟骨球用1×PBS清洗后，浸泡于4%多聚甲醛溶液（或10%福爾馬林溶液），固定30min以上。注意：固定液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 脫水。固定好的軟骨球使用梯度濃度酒精脫水，方式如下，每一階段30 min。

50%酒精→70%酒精→80%酒精→95%酒精→無(wú)水酒精

注意：

1）脫水必須在有蓋的容器中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分；

2）軟骨球不要在酒精中浸泡太久，易碎裂；

3）在更換酒精時(shí)，可吸出低濃度酒精，再加入高濃度酒精。避免移動(dòng)增加軟骨球碎裂的風(fēng)險(xiǎn)。

3. 透明。因酒精和石蠟不相溶，所以脫水后需經(jīng)二甲苯過(guò)渡。方式如下：

• 二甲苯和無(wú)水酒精按體積比 1:1 混勻。將軟骨球浸泡其中 2 h。
• 將軟骨球浸泡在純二甲苯中 1.5 h。
• 更換新的二甲苯，繼續(xù)浸泡 1 h。

注意：

1）透明必須在有蓋的容器中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分；

2）透明過(guò)程中，如果軟骨球周?chē)�出現(xiàn)白色霧狀氣泡，說(shuō)明其中水未被脫凈。應(yīng)重新放回酒精中脫水再透明。

4. 浸蠟。為了除去軟骨球中的透明劑，使石蠟滲透到內(nèi)部以便包埋，需要浸蠟處理。

• 二甲苯和石蠟按體積比 1:1 混勻。將軟骨球浸泡其中，再一起放置于 40℃烘箱中 40 min。
• 將軟骨球浸泡在純石蠟中，放置于 55℃烘箱中 30 min。

注意：1）浸蠟盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，石蠟不凝固即可；

2）溫度要恒定，不可忽高忽低。

5. 包埋。將軟骨球取出，置于模具中。倒入石蠟，靜置冷卻。待石蠟充分冷卻成形，取出，修整蠟塊。

6. 切片。連續(xù)切片，每片厚度 3 μm。

7. 粘片。將軟骨球切片用粘貼劑粘附于載玻片上，在 35℃烘箱中烘干。

8. 脫臘。

• 純二甲苯浸泡切片 15 min，更換新的二甲苯浸泡切片 10 min。
• 二甲苯和無(wú)水酒精按體積比 1:1 混勻。浸泡切片 10 min。
• 依次使用 95%、85%、70%、50%酒精浸泡切片 10 min，晾干。

9. 染色。

• 在晾干的切片上滴加阿利辛藍(lán)，37℃染色 1 h。
• 用自來(lái)水沖洗載玻片 5 min，晾干。

10. 顯微鏡下觀察阿利辛藍(lán)染色效果。阿利辛藍(lán)染色部分顯示的是軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖。