外泌體是由活細(xì)胞分泌的直徑約為30-150nm的小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)。近年來，越來越多的證據(jù)顯示外泌體可以作為細(xì)胞間信息傳遞的媒介發(fā)揮作用。云序客戶同濟(jì)大學(xué)東方醫(yī)院的周曉慧、范慧敏團(tuán)隊(duì)在Journal of Extracellular Vesicles雜志上發(fā)表的“Myocardial ischemia-reperfusion induced cardiac extracellular vesicles harbour proinflammatory features and aggravate heart injury”文章，通過云序生物提供的外泌體miRNA測序，揭示了缺血再灌注（IR）中存在的IR-EVs-miR-155-5p-M1型極化軸，可導(dǎo)致局部和全身炎癥，并提出GW4869抑制EVs可能是一種有前途的IR損傷治療策略。
發(fā)表期刊：Journal of Extracellular Vesicles
發(fā)表時(shí)間：2021年2月23日
樣本類型：小鼠缺血—再灌注（IR）心臟外泌體
研究方法：外泌體miRNA測序、RT-qPCR
文章鏈接：Myocardial ischemia-reperfusion induced cardiac extracellular vesicles harbour proinflammatory features and aggravate heart injury
     
急性心肌梗死是一個(gè)發(fā)病率和死亡率較高的全球性問題。快速恢復(fù)冠狀動脈血流是減少心肌梗死和改善心功能的最有效策略。然而，再灌注會導(dǎo)致不可逆的心肌損傷，被稱為心肌缺血-再灌注（IR）損傷。目前，IR損傷的機(jī)制尚不明確，仍缺乏有效的治療方法。炎癥是維持體內(nèi)平衡的基本生物學(xué)過程，但過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織損傷。巨噬細(xì)胞是心肌梗死觸發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要效應(yīng)因子和調(diào)節(jié)因子，其中M1型巨噬細(xì)胞是促炎類型，在促炎細(xì)胞細(xì)胞因子的吞噬和分泌中起重要作用。細(xì)胞外囊泡（EVs）是一種具有雙層脂膜的細(xì)胞來源的納米級囊泡，越來越多的證據(jù)證實(shí)了EVs作為細(xì)胞間通信載體的重要作用。最近的研究揭示了EVs在炎癥調(diào)節(jié)中的功能，并證實(shí)了EVs通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化參與各種疾病的發(fā)展，然而IR誘導(dǎo)的EVs作用仍然有待披露。大量研究表明非編碼RNA在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，特別是miRNA。心臟IR-EVs和EVs傳遞的miRNA是否以及如何在IR損傷中發(fā)揮其作用，目前尚不清楚。
  1、IR引起心臟EVs改變
通過透射電鏡觀察來自對照組與IR損傷心臟的EVs，典型的四種外泌體標(biāo)記物CD63、CD9、Alix和TSG101在兩組中均表達(dá)，IR損傷增加了EVs的釋放量，并沒有顯著調(diào)節(jié)EVs的大小。
2、IR-EVs加重了IR誘導(dǎo)的心臟損傷，促進(jìn)IR損傷心臟中巨噬細(xì)胞的M1型極化
為了進(jìn)一步闡明IR-EVs在心臟IR損傷中的作用，將IR-EVs用DiR標(biāo)記后注射到sham組與IR損傷組心臟中。生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，IR-EVs在注射后24h可保留在心臟內(nèi)與注射PBS的組相比，IR-EVs顯著損害心臟功能，增加梗死面積。說明IR-EVs會加重IR誘導(dǎo)的心臟損傷。
巨噬細(xì)胞極化在IR誘導(dǎo)的心臟損傷和修復(fù)中起重要作用。因此研究人員試圖確定IR-EVs是否調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。結(jié)果顯示，IR-EVs顯著增強(qiáng)IR損傷心臟中M1極化標(biāo)記基因NOS2和促炎細(xì)胞因子IL1β、IL6和TNFα表達(dá)，而與M2極化相關(guān)的Arg1、MRC1、Fizz1和IL10的mRNA水平則大幅下降。增強(qiáng)了IR損傷小鼠心臟和循環(huán)白細(xì)胞中Ccl2、Ccl4、Cxcl4、Cxcl1和Cxcl2的表達(dá)，降低IR損傷小鼠循環(huán)白細(xì)胞中IL10表達(dá)。心臟組織免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示IR-EV輸血促進(jìn)了CD45+炎癥細(xì)胞和CD45+F4/80+巨噬細(xì)胞的浸潤。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了IR-EVs能夠加劇局部炎癥，促進(jìn)巨噬細(xì)胞滲入損傷心臟，并促進(jìn)其M1型極化。
3、抑制EVs的產(chǎn)生可減輕心肌IR損傷，減輕局部炎癥
研究人員使用GW4869（外泌體抑制劑）探索抑制EVs對IR誘導(dǎo)的心肌損傷的影響。結(jié)果顯示，注射GW4869處理能夠顯著改善了IR損傷小鼠的心臟功能，減少梗死面積，降低心肌酶水平，并且抑制了NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達(dá)。與IR小鼠相比，GW4869處理的IR小鼠心臟中促炎趨化因子Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的表達(dá)減少，并且減少了IR損傷心臟中CD45+炎癥細(xì)胞和CD45+F4/80+巨噬細(xì)胞的浸潤。GW4869抑制IR-EVs對心臟的保護(hù)作用進(jìn)一步表明IR誘導(dǎo)的EVs參與心臟IR損傷，促進(jìn)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。
 
4、IR-EVs可在體外編程巨噬細(xì)胞M1型極化
為了進(jìn)一步闡明IR-EVs對巨噬細(xì)胞極化的作用，研究人員用原代腹腔巨噬細(xì)胞和IR-EVs進(jìn)行體外共培養(yǎng)。結(jié)果表明，IR-EVs能夠促進(jìn)M1型極化相關(guān)基因NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達(dá)，并且表達(dá)水平隨著IR-EVs濃度的增加而增加。降低M2型極化相關(guān)基因MRC1、Fizz1和IL10的表達(dá)，提高促炎因子IL1β、IL6和TNFα的蛋白水平，并且趨化因子Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的mRNA表達(dá)水平也顯著升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IR后大量IR-EVs的釋放可能是促進(jìn)趨化因子和炎癥因子產(chǎn)生的因素之一。此外，IR-EVs處理顯著提高了吞噬相關(guān)基因的表達(dá)，并促進(jìn)了腹腔巨噬細(xì)胞PMφ和骨髓源性巨噬細(xì)胞BMDMs的吞噬活性。
5、MiR-155-5p是IR-EVs介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的候選效應(yīng)因子
EVs通過傳遞miRNA而被稱為細(xì)胞間的通信載體。因此，研究人員對來自sham和IR組的心臟EVs進(jìn)行miRNA測序（3v3），來確定候選miRNA效應(yīng)因子。鑒定獲得的差異表達(dá)的miRNAs，并對在IR-EVs中前十個(gè)高表達(dá)的miRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。
共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，IR-EVs可以被巨噬細(xì)胞攝取。為了進(jìn)一步確定候選miRNA，在與IR-EVs共培養(yǎng)的PMφ中檢測高表達(dá)前三的miRNA。與S-EVs共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相比，與IR-EVs共培養(yǎng)的PMφ中miR-155-5p表達(dá)量顯著上調(diào)，并且miR-155-5p表達(dá)量與IR-EVs呈正相關(guān)。因此，推測miR-155-5p可能是IR-EVs中具有關(guān)鍵作用的候選效應(yīng)因子。
6、IR-EVs中miR-155-5p通過IAK2/STAT1通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化
在與IR-EVs共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，研究人員證實(shí)了IR-EVs濃度和NOS2表達(dá)正相關(guān)，miR-155-5p表達(dá)和NOS2表達(dá)正相關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-155-5p 模擬物能增加促炎因子表達(dá)，降低抗炎細(xì)胞因子IL10表達(dá)。此外，心臟內(nèi)給藥agomiR-155能夠重現(xiàn)IR-EVs促炎作用，IL1β、IL6和TNFα表達(dá)增加，IL10表達(dá)降低。
已有研究表明，JAK/STAT1是巨噬細(xì)胞M1型極化的重要調(diào)控通路。IR-EVs能夠顯著提高PMφ中總JAK2和磷酸化JAK2的表達(dá)下游分子STAT1也被激活。在巨噬細(xì)胞中加入miR-155-5p模擬物也同樣激活了JAK2/STAT1通路。并且miR-155-5p模擬物能進(jìn)一步增強(qiáng)IR-EVs誘導(dǎo)的JAK2/STAT1激活作用。miR-155-5p抑制劑會抑制巨噬細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT1蛋白升高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明了miR-155-5p通過激活JAK2/STAT1參與IR-EVs調(diào)控的巨噬細(xì)胞M1型極化。
7、IR-EVs能夠?qū)е逻h(yuǎn)端器官的全身炎癥
前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明IR-EVs能夠?qū)е滦呐K的局部炎癥，那么IR-EVs是否在其他器官中發(fā)揮作用？研究人員證實(shí)了心肌IR損傷觸發(fā)了循環(huán)中EVs釋放增加，IR損傷促進(jìn)循環(huán)中促炎細(xì)胞因子(IL1β和IL6)和趨化因子(Cxcl1和Cxcl2)的分泌，除了心臟組織，在肺、肝、腎、脾等遠(yuǎn)處器官中均出現(xiàn)了促炎基因表達(dá)增加的情況。GW4869治療減少了IR損傷小鼠的循環(huán)中促炎因子和趨化因子的釋放，降低心肌IR誘導(dǎo)的遠(yuǎn)處器官的促炎基因表達(dá)。
生物發(fā)光成像顯示，對正常小鼠靜脈注射DiR標(biāo)記的IR-EVs24h后，IR-EVs存在于不同器官中，在循環(huán)白細(xì)胞及各器官中均檢測到促炎基因表達(dá)升高，并且上調(diào)了多個(gè)器官中CD45+和CD45+F4/80+細(xì)胞的表達(dá)。表明IR-EVs在心臟IR損傷期間能夠促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)。   最近的研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞外囊泡（EVs）作為細(xì)胞間的通信載體在各種疾病的發(fā)展中的重要作用，然而對于組織源性EVs的特征和功能知之甚少。該研究通過外泌體外泌體miRNA測序、RT-qPCR等技術(shù)，揭示了一種基于心臟EVs參與心肌缺血再灌注（IR）損傷機(jī)制。IR誘導(dǎo)EVs（IR-EVs）可通過IR-EVs-miR-155-5p-M1極化軸促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重心臟炎癥，并且IR-EVs促進(jìn)局部和全身炎癥，這支持了IR-EVs在心臟炎癥中的作用，以及心臟和其他器官之間的及時(shí)通信。GW4869對心臟IR的保護(hù)作用提示了早期抑制有害的EVs應(yīng)該是一種有前途的治療策略。