斑馬魚是一種原產(chǎn)于南亞地區(qū)的小型熱帶淡水魚，成魚體長(zhǎng)只有3厘米左右。斑馬魚發(fā)育速度快，受精后3天左右主要組織器官發(fā)育已經(jīng)完成，5天左右開口進(jìn)食，約3個(gè)月達(dá)到性成熟，壽命可達(dá)2年以上。由于斑馬魚是體外受精發(fā)育并且胚體透明，因此其組織器官的發(fā)育和變化、血流、心跳等都可以在顯微鏡下直接進(jìn)行觀察。
 

 

斑馬魚跟哺乳動(dòng)物相比，具有飼養(yǎng)密度高（100㎡可養(yǎng)殖2-3萬(wàn)尾成年斑馬魚、養(yǎng)殖成本低（小鼠的1/10）、實(shí)驗(yàn)通量高（可在96孔板中進(jìn)行高通量分析）、所需要的樣品量少（100mg以內(nèi)）、便于活體觀察、實(shí)驗(yàn)周期短（大部分實(shí)驗(yàn)5天以內(nèi)可以完成）、繁殖能力強(qiáng)（每隊(duì)親本一次可繁殖200枚左右胚胎）等顯著優(yōu)勢(shì)。

由于斑馬魚和人類基因有著87%的高度同源性，作為模式生物的優(yōu)勢(shì)很突出，是重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，堪稱“水中小白鼠”，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多數(shù)情況下適用于人體。

目前斑馬魚模式動(dòng)物常用于以下研究領(lǐng)域：

1. 癌癥發(fā)病機(jī)理研究和抗癌藥篩選

2. 神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究

3. 代謝性疾病研究

4. 藥物毒性評(píng)價(jià)

5. 免疫學(xué)研究

在高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)中，斑馬魚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮趯W(xué)習(xí)與記憶中的應(yīng)用比果蠅、海兔等更加廣泛。斑馬魚的學(xué)習(xí)可以在很多行為中得到體現(xiàn)，如社會(huì)交流、覓食、航行及捕食逃避等。在斑馬魚的學(xué)習(xí)行為實(shí)驗(yàn)中，可以使用T迷宮，條件位置偏愛等來(lái)探討年齡對(duì)斑馬魚學(xué)習(xí)與記憶功能的影響。
 

 

（斑馬魚T迷宮，條件位置偏愛箱行為實(shí)驗(yàn)圖）

除此之外，作為一種白晝活動(dòng)的魚類，斑馬魚有明顯的晝夜節(jié)律，體內(nèi)的激素水平也會(huì)有一個(gè)周期性的變化。斑馬魚也會(huì)發(fā)生晝夜節(jié)律性的睡眠，對(duì)于睡眠時(shí)期的行為觀察，一般常用的手段是使用具有紅外線感應(yīng)功能的照相機(jī)，分析其呼吸頻率、心跳頻率和腮動(dòng)頻率，再結(jié)合電生理方面的知識(shí)，從而對(duì)斑馬魚的睡眠有一個(gè)較全面的了解。

野外條件下，當(dāng)斑馬魚在下雨天或是在渾濁的水中游動(dòng)時(shí)，其視覺感知功能十分有限，因此除了嗅覺可能在這其中起作用外，斑馬魚具有的磁場(chǎng)感知功能也會(huì)發(fā)揮作用，這在斑馬魚的遷移過(guò)程中顯得更加重要。

1~2 周齡的斑馬魚已具有成年動(dòng)物的多種復(fù)雜行為和腦功能，但其大腦相對(duì)較小，以 1 周齡為例，約為300(背腹軸)×500(左右軸)×800(頭尾軸) μm3，含有數(shù)萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元。在 10~20 倍物鏡下，可觀察其大腦全貌；通過(guò)透明的皮膚可清楚分辨單個(gè)神經(jīng)元的形態(tài)，從而可以實(shí)現(xiàn)在全腦尺度上對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)進(jìn)行在體電生理或光學(xué)成像記錄。
 

（斑馬魚鈣成像模式圖）

神經(jīng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)接受和處理各種信息，評(píng)估周圍環(huán)境和自身狀態(tài)，做出有利于機(jī)體生存繁衍的行為和認(rèn)知決策。對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的研究，目的是闡明神經(jīng)元及其組成的神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)和功能是如何實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的認(rèn)知和行為。近年來(lái)，在斑馬魚視覺和嗅覺系統(tǒng)方面所取得的研究進(jìn)展，為揭示感覺信息加工和處理的機(jī)制提供了新的線索。

// 視網(wǎng)膜功能
雙極細(xì)胞(bipolar cell，BC)是視網(wǎng)膜神經(jīng)環(huán)路中第二級(jí)神經(jīng)元，其對(duì)光反應(yīng)特性是視覺信息加工和處理的重要一環(huán)。通過(guò)鈣成像方法，將定位到突觸前的SynGCaMP2特異性地表達(dá)在雙極細(xì)胞中，在活體斑馬魚上監(jiān)測(cè)這些神經(jīng)元軸突終末的神經(jīng)活動(dòng)。不論是給光反應(yīng)(on response，ON)還是撤光反應(yīng)(off response，OFF)、瞬時(shí)活動(dòng)還是持續(xù)活動(dòng)，雙極細(xì)胞的軸突末都表現(xiàn)出類似于動(dòng)作電位的“全或無(wú)”式的快速鈣活動(dòng)，且這種活動(dòng)受到視覺輸入的調(diào)節(jié)。

使用類似方法觀察突觸遞質(zhì)囊泡在細(xì)胞膜上的融合過(guò)程，通過(guò)給予不同強(qiáng)度的光刺激并記錄相應(yīng)的突觸反應(yīng)，約有 1/2 表現(xiàn)出非線性的特點(diǎn): 當(dāng)光刺激強(qiáng)度逐漸增加時(shí)，其反應(yīng)經(jīng)過(guò)一個(gè)極小值和一個(gè)極大值后方達(dá)到平臺(tái)期。這種非線性突觸具有更大的動(dòng)態(tài)范圍，可以更為有效地傳遞視覺信息�；顒�(dòng)逐漸增強(qiáng)的突觸與無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(amacrine cell，AC)的突起在空間位置上重疊，提示后者可能是調(diào)節(jié)的來(lái)源。光學(xué)成像記錄無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞對(duì)視覺刺激的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其活動(dòng)逐漸降低，可能導(dǎo)致分布在同一亞層的雙極細(xì)胞所接受的反饋性抑制性輸入下降，從而使得雙極細(xì)胞的反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，藥理實(shí)驗(yàn)也有同樣的發(fā)現(xiàn)。

使用在體電生理記錄方法，可以系統(tǒng)地分析視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能發(fā)育。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在不同發(fā)育階段的氯離子平衡電位(ECl-)，即抑制性突觸輸入的反轉(zhuǎn)電位，在發(fā)育過(guò)程中逐漸向超極化方向偏移 ，從而使得抑制性神經(jīng)遞質(zhì)伽馬氨基丁酸 (γ- Aminobutyric acid，GABA)引起的反應(yīng)由發(fā)育早期的興奮性向發(fā)育晚期的抑制性轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變的時(shí)間節(jié)點(diǎn)與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)的出現(xiàn)有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
 

（微量注射/膜片鉗解決方案）

// 視覺朝向選擇型和方向選擇型的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制

為了實(shí)現(xiàn)有效的信息編碼，很多神經(jīng)細(xì)胞會(huì)選擇性地對(duì)感覺輸入的某一特征(比如運(yùn)動(dòng)信息)作出反應(yīng)，這一過(guò)程稱為特征檢測(cè)(feature detection)。斑馬魚的視覺中樞即視頂蓋(optic tectum)位于斑馬魚中腦背部，接受神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突投射，并將信息傳遞至下游的多個(gè)腦區(qū)，在視覺相關(guān)行為中起關(guān)鍵作用。一方面，視頂蓋中有為數(shù)眾多的神經(jīng)元其視覺反應(yīng)具有方向選擇性或朝向選擇性; 另一方面，視頂蓋空間位置和相對(duì)清晰的投射結(jié)構(gòu)便于光學(xué)成像，因此，該腦區(qū)很適合研究特征檢測(cè)的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制。

根據(jù)投射關(guān)系，可以推測(cè)視頂蓋神經(jīng)元的方向選擇性和朝向選擇性有2個(gè)可能的來(lái)源: 來(lái)自投射神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，或來(lái)自視頂蓋內(nèi)部的抑制性突觸。局部抑制性突觸傳遞對(duì)于視頂蓋神經(jīng)元的方向選擇性是必要的，且這些神經(jīng)元所接受的抑制性輸入確實(shí)具有方向選擇性。當(dāng)用運(yùn)動(dòng)光條刺激斑馬魚時(shí)，閾下反應(yīng)中的抑制性成分較興奮性成分具有更強(qiáng)的方向選擇性，其方向偏好性與細(xì)胞閾上反應(yīng)(即動(dòng)作電位反應(yīng))的相反。此外，對(duì)于神經(jīng)元偏好的方向，抑制性突觸輸入的潛伏期更長(zhǎng); 而對(duì)于相反方向的刺激，抑制性輸入的潛伏期更短。

視頂蓋神經(jīng)元通過(guò)不對(duì)稱方式接受鄰近中間神經(jīng)元的抑制性輸入，從而獲得方向選擇性，而發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的特定投射關(guān)系使得頂蓋神經(jīng)元從前一級(jí)輸入獲得方向選擇性; 進(jìn)一步，視頂蓋來(lái)源的具有方向選擇性的抑制性輸入使得頂蓋神經(jīng)元的選擇性更為顯著。

// 視覺捕食行為的機(jī)制
斑馬魚視覺行為的一個(gè)主要功能是在捕食過(guò)程中識(shí)別并追蹤獵物。使用不同大小的運(yùn)動(dòng)光點(diǎn)作為視覺刺激，發(fā)現(xiàn) 1 度視角的光點(diǎn)可以引起自由游動(dòng)的斑馬魚匯聚雙眼并朝向光點(diǎn)游動(dòng)，類似于草履蟲誘發(fā)的捕食行為。采用不同寬度的運(yùn)動(dòng)光條作為刺激，相對(duì)于視角 16°及以上的寬光條，窄小的刺激在該處引起的反應(yīng)更強(qiáng)。與此不同的是，接受神經(jīng)節(jié)輸入的頂蓋淺層區(qū)域缺乏對(duì)光條寬度的選擇性，提示頂蓋內(nèi)的神經(jīng)信息處理對(duì)于深部纖維的偏好性至關(guān)重要。頂蓋表層中有一群中間神經(jīng)元表現(xiàn)出相反的偏好性，對(duì)于16°以上的運(yùn)動(dòng)光條有著更強(qiáng)的反應(yīng)，提示這群神經(jīng)元的抑制性輸入可能造就了頂蓋深部活動(dòng)的選擇性。進(jìn)一步，去除或抑制這些神經(jīng)元的活動(dòng)，可使頂蓋深部的神經(jīng)活動(dòng)失去選擇性，并降低了斑馬魚的捕食能力。

// 小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)視覺功能的調(diào)節(jié)
小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，激活態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞參與一系列免疫反應(yīng)及組織修復(fù)過(guò)程。目前以斑馬魚為模式動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)了靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間存在雙向的功能調(diào)節(jié)。通過(guò)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化和神經(jīng)元活動(dòng)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程在體記錄，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元活動(dòng)升高后，小膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元靠近并與其胞體形成緊密接觸，形成接觸后神經(jīng)元活動(dòng)降低，這兩組現(xiàn)象之間存在相關(guān)性。人為局部增強(qiáng)神經(jīng)元活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)可以吸引小膠質(zhì)細(xì)胞的突起靠攏并促進(jìn)緊密接觸的形成，進(jìn)而削弱被接觸神經(jīng)元的自發(fā)性電活動(dòng)以及視覺反應(yīng)。

>> 下篇文章將詳解斑馬魚嗅覺及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)信號(hào)研究進(jìn)展，大家敬請(qǐng)期待噢~

瑞沃德神經(jīng)信號(hào)研究方案，涵蓋神經(jīng)信號(hào)調(diào)控，在體神經(jīng)信號(hào)記錄、離體神經(jīng)信號(hào)記錄等多種實(shí)驗(yàn)方法，從神經(jīng)元單細(xì)胞、神經(jīng)元群體、再到整個(gè)神經(jīng)環(huán)路等不同水平，為神經(jīng)科學(xué)提供系統(tǒng)全面的整體解決方案，助力神經(jīng)環(huán)路解析及神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制研究的發(fā)展。

【參考文獻(xiàn)】

Chun-feng Shang*, Yu Mu, Jiu-lin Du*.Zebrafish Swimming into Neuroscience Research: A Visible Mind in A Transparent Brain.Scientia Sinica (2015).

Tristan Darland* and John E. Dowling. Behavioral screening for cocaine sensitivity in mutagenized zebrafish.PNAS(2001).