很多老師在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞總是會(huì)莫名其妙的就被污染了，同樣的實(shí)驗(yàn)人員，同樣的環(huán)境，同樣的培養(yǎng)體系，可是細(xì)胞還是有污染。
試劑、耗材已經(jīng)使用控制變量法進(jìn)行過(guò)排查，那么還有什么方面可能會(huì)導(dǎo)致污染呢？

 ———— 細(xì)胞房環(huán)境污染（空氣中的沉降菌）

 

Vol.1
有關(guān)沉降菌的術(shù)語(yǔ)與定義

沉降菌
通過(guò)使用專門的培養(yǎng)基，并按照以下標(biāo)準(zhǔn)提及的方法，收集空氣中的活微生物粒子，在適宜的條件下，繁殖到肉眼可見(jiàn)的菌落數(shù)。通過(guò)自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經(jīng)若干時(shí)間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見(jiàn)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，以平板培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)來(lái)判定潔凈環(huán)境內(nèi)的活微生物數(shù)，并以此來(lái)評(píng)定潔凈室（區(qū)）的潔凈度。

沉降菌菌落數(shù)
規(guī)定時(shí)間內(nèi)每個(gè)平板培養(yǎng)皿收集到空氣中沉降菌的數(shù)目，以個(gè)/皿表示。

靜態(tài)a
潔凈室（區(qū)）在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)已安裝完畢且功能完備的情況下，生產(chǎn)工藝設(shè)備已安裝、潔凈室（區(qū)）內(nèi)沒(méi)有生產(chǎn)人員的狀態(tài)。

靜態(tài)b
潔凈室（區(qū)）在生產(chǎn)操作全部結(jié)束，生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)場(chǎng)并經(jīng)過(guò)20min 自凈后。

動(dòng)態(tài)
潔凈室（區(qū)）已處于正常生產(chǎn)狀態(tài)，設(shè)備在指定的方式下進(jìn)行，并且有指定的人員按照規(guī)范操作。

標(biāo)準(zhǔn)：
1. GB/T 16292-2010 《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）》懸浮粒子的測(cè)試方法》
2. GB/T 16294-2010 《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）》沉降菌的測(cè)試方法》
 

Vol.2
如何進(jìn)行檢測(cè)

1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
試劑：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）

圖1. 大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基

 

布置要求：
采樣點(diǎn)布置宜力求均勻，避免采樣點(diǎn)在局部區(qū)域過(guò)于稀疏；細(xì)胞房、安全柜、超凈臺(tái)建議下列布置圖：

圖2.平面采樣點(diǎn)布置圖

參照醫(yī)藥工業(yè)潔凈室沉降菌的測(cè)試方法細(xì)胞房、安全柜、超凈臺(tái)建議布置圖中，我們選取五點(diǎn)取樣法。（大家可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況進(jìn)行選擇，具體沒(méi)有規(guī)定限制取樣布置圖）

圖3. 生物安全柜布置圖
 

最小培養(yǎng)皿數(shù)：

注：常規(guī)超凈臺(tái)或安全柜潔凈度級(jí)別：100級(jí)；常規(guī)細(xì)胞房潔凈度級(jí)別：10000級(jí)；這里的最小培養(yǎng)皿數(shù)是所有采樣點(diǎn)皿數(shù)總和。

3. 生物安全柜、細(xì)胞房及開(kāi)放環(huán)境測(cè)試步驟
 

生物安全柜

① 選擇狀態(tài)：
●  靜態(tài)a測(cè)試時(shí)：生物安全柜應(yīng)開(kāi)機(jī)運(yùn)行不少于10min；細(xì)胞房?jī)艋�空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運(yùn)行時(shí)間不少于30min后開(kāi)始。 
●  靜態(tài)b測(cè)試時(shí)：生物安全柜宜在操作人員撤離現(xiàn)場(chǎng)并經(jīng)過(guò)10min自凈后開(kāi)始；細(xì)胞房宜在操作人員撤離現(xiàn)場(chǎng)并經(jīng)過(guò)20min自凈后開(kāi)始。
●  動(dòng)態(tài)測(cè)試：則須記錄生產(chǎn)開(kāi)始的時(shí)間以及測(cè)試時(shí)間。

② 培養(yǎng)皿表面必須嚴(yán)格消毒，將培養(yǎng)皿按采樣點(diǎn)布置圖逐個(gè)放置，然后從里到外逐個(gè)打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋（避免人衣物上微生物的掉落干擾實(shí)驗(yàn)），使培養(yǎng)基表面暴露在空氣中。
●  靜態(tài)測(cè)試時(shí)，培養(yǎng)皿暴露時(shí)間在30min以上，室內(nèi)測(cè)試人員不得多于2人。
●  動(dòng)態(tài)測(cè)試時(shí)，培養(yǎng)皿暴露時(shí)間為不大于4h。

圖4. 桌面

圖5. 離心機(jī)

圖6. 顯微鏡
 

圖7. 培養(yǎng)箱
 

圖8. 傳遞窗

開(kāi)放環(huán)境

圖9. 開(kāi)放環(huán)境桌面放置
 

④ 全部采樣結(jié)束后，收樣時(shí)需從外到里逐個(gè)蓋上培養(yǎng)皿蓋（同樣避免人衣物上微生物的掉落干擾實(shí)驗(yàn)），做好相應(yīng)標(biāo)記后將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不少于48h。
⑤ 每批培養(yǎng)基應(yīng)有對(duì)照試驗(yàn)，檢查培養(yǎng)基本身是否污染�？蛇x定每批3只培養(yǎng)皿不打開(kāi)作對(duì)照培養(yǎng)。

4. 陽(yáng)性對(duì)照測(cè)試
為避免無(wú)陽(yáng)性對(duì)照，我們邀請(qǐng)技術(shù)同事將手指點(diǎn)涂在培養(yǎng)基上進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。兩天后可明顯觀察到菌落的生成。

圖10. 手指部位陽(yáng)性對(duì)照組


圖11. 手指部位陽(yáng)性對(duì)照組（放大圖）

肉眼可以觀察到明顯的菌落形成，成片的是菌落重疊生長(zhǎng)聚集在了一起，很難分辨出具體有多少個(gè)菌落。
※  平時(shí)我們的手上會(huì)攜帶大量的菌

Vol.3
測(cè)試結(jié)果判定

可直接觀察：

圖12. 批次對(duì)照組

由圖可以看出對(duì)照組都未長(zhǎng)菌。




圖13. 生物安全柜污染點(diǎn)取樣
可以看出生物安全柜無(wú)污染。



圖14. 細(xì)胞房以污染點(diǎn)取樣

由圖可以看出我公司細(xì)胞房?jī)?nèi)潔凈程度達(dá)標(biāo)，無(wú)污染。

 

圖15. 開(kāi)放環(huán)境桌面取樣
開(kāi)放環(huán)境下，肉眼可以看到有菌落形成
 

菌落計(jì)數(shù)：
●  用肉眼對(duì)培養(yǎng)基上的所有菌落直接計(jì)數(shù)、標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。
●  若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上的菌落計(jì)數(shù)。
●  平均菌落的計(jì)算，如下：

 平均菌落數(shù)M=（M1+M2+...Mn）/n

注意事項(xiàng)：
★  測(cè)試用具要做滅菌處理，以確保測(cè)試的可靠性、正確性
★  采取一切措施防止人為對(duì)樣本的污染。
★  對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。
★  由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計(jì)培養(yǎng)皿邊緣生長(zhǎng)的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。
★  采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。
★  沉降菌檢測(cè)使用的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基不一定適養(yǎng)支原體，所以不代表無(wú)支原體污染。

監(jiān)測(cè)頻率：
★  如果生物安全柜所處的環(huán)境為十萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)，可每三個(gè)月測(cè)試一次;
★  如果生物安全柜所處的環(huán)境為萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)，至少每個(gè)月監(jiān)測(cè)一次沉降菌;
★  如果沉降菌連續(xù)幾次監(jiān)測(cè)不合格，則考慮更換生物安全柜的高效過(guò)濾器。
 

 

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