心肌纖維化是多種病理因素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)的改變，可造成心臟收縮和舒張功能障礙，引起心肌功能、代謝等異常，是常見心血管疾病發(fā)生發(fā)展到某一階段的主要病理表現(xiàn)。

研究表明心臟纖維化與心肌成纖維細(xì)胞（CFbs）密切相關(guān)， CFbs在心臟損傷反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，但由于遺傳背景多樣性和心臟成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性阻礙了CFbs對(duì)調(diào)節(jié)心臟纖維化的分子機(jī)制的研究。

2018年發(fā)表在頂級(jí)心血管雜志Circulation上的文獻(xiàn)Genetic Regulation of Fibroblast Activation and Proliferation in Cardiac Fibrosis，作者采用雜交小鼠多樣性組(HMDP)來探究遺傳多樣性的心肌成纖維細(xì)胞及其在纖維化中的作用，揭示了遺傳背景特異性會(huì)影響心功能障礙和病理性纖維化的發(fā)展進(jìn)程，并驗(yàn)證心肌成纖維化細(xì)胞的激活對(duì)于心肌纖維化程度的貢獻(xiàn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了心肌纖維化的潛在標(biāo)記基因。

異丙腎上腺素(isoproterol, ISO)是一種非選擇性-腎上腺素能激動(dòng)劑，被廣泛用于誘發(fā)小鼠心臟損傷、心肌肥大、纖維化等模型。之前的研究表明，異丙腎上腺素處理后的雜交小鼠多樣性組各品系間的心臟病理生理學(xué)和纖維化表現(xiàn)出顯著性差異�；�于這種差異性，本文作者選擇了三種具有代表性的小鼠品系:C57BL/6J、C3H/HeJ和KK/HIJ（它們分別在ISO處理后表現(xiàn)出輕度、中度和最嚴(yán)重的心肌纖維化（圖1A））進(jìn)行研究，通過腹腔植入緩釋泵進(jìn)行ISO慢性給藥，ISO劑量30mg/kg /d，持續(xù)21天構(gòu)建心肌纖維化模型。
 

RWD 植入式緩釋泵
通過滲透泵釋放ISO已是常用的造模手段，此方式構(gòu)建的慢性心肌纖維化模型具備穩(wěn)定、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可模擬人類晚期心力衰竭的病理特征。

1、一次埋置操作，可實(shí)現(xiàn)最長4周持續(xù)給藥

2、給藥速率穩(wěn)定，保證每日給藥量一致

3、泵體體積小，減少對(duì)動(dòng)物自由活動(dòng)的影響

4、減少頻繁處理動(dòng)物帶來的應(yīng)激刺激

作者首先對(duì)這三種不同遺傳背景的小鼠進(jìn)行ISO誘導(dǎo)后的心功能和纖維化的病理分析，心臟組織切片Masson三色染色顯示，ISO處理后，C3H/HeJ和KK/HlJ品系小鼠心臟均表現(xiàn)出清晰的纖維化區(qū)域(藍(lán)色)，而C57BL/6J心肌纖維化面積最小（圖1B），進(jìn)一步的功能超聲心動(dòng)圖分析顯示C3H/HeJ和KK/HlJ品系的射血分?jǐn)?shù)（EF）顯著降低，相比之下，ISO處理的C57BL/6J小鼠心功能基本沒受到損害（圖1D），實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了慢性ISO刺激不同品系小鼠會(huì)導(dǎo)致不同程度的心肌纖維化。
 

圖1. ISO處理后不同品系(C57BL/6J, C3H/HeJ, KK/HIJ)的心肌纖維化程度不同

基于上述三種品系所表現(xiàn)出的不同程度的纖維化模式，作者接下來通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究不同品系小鼠的心肌成纖維細(xì)胞在心肌纖維化模式中的潛在作用。首先是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從三種品系小鼠得到的原代心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)過分選，擴(kuò)增，傳代，并暴露于ISO 72小時(shí)之后，作者試圖確定這三種品系小鼠的CFbs是否表現(xiàn)出類似的激活和增殖模式。膠原蛋白1 (Col1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)和磷酸化組蛋白H3 (pHH3)分別用于心肌纖維細(xì)胞、細(xì)胞活化和增殖的標(biāo)記。細(xì)胞染色可以發(fā)現(xiàn)ISO處理后，來自C3H/HeJ和KK/HlJ這兩個(gè)品系的CFbs有很大比率共表達(dá)αSMA和Col1，而來自C57BL/6J 的CFbs的αSMA表達(dá)量最小，pHH3的細(xì)胞染色則顯示三種品系的CFbs增殖水平類似（圖2B、C、E）。這些體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，CFbs以小鼠品系特異性的方式響應(yīng)ISO，ISO處理不同品系的CFbs會(huì)導(dǎo)致不同的激活水平，但品系間CFbs的增殖水平?jīng)]有顯著性差異。
 

圖2. 體外ISO處理后小鼠品系的特異性影響CFbs的激活和增殖方式

作者接著進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，ISO處理后，許多Col1+細(xì)胞在C3H/HeJ和KK/HlJ心肌的血管周和間質(zhì)區(qū)共表達(dá)αSMA，并且CFbs激活水平與各品系小鼠的纖維化程度相對(duì)應(yīng)（圖3A、B）；采用BrdU染色標(biāo)記增殖細(xì)胞，在ISO處理后，可以觀察到血管周圍和間質(zhì)中BrdU+/CFbs細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，且三種品系增殖的數(shù)量相近，具備相似的CFbs增殖模式（圖3D、E），與體外結(jié)果一致。以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心肌病理纖維化程度直接與CFbs的活化水平相關(guān)，而不是CFbs增殖水平有關(guān)。
 

圖3. 體內(nèi)ISO處理后小鼠品系的特異性影響CFbs的激活和增殖方式

為了進(jìn)一步闡述CFbs對(duì)于纖維化的內(nèi)在機(jī)制，作者接下來對(duì)經(jīng)ISO處理的這三種品系小鼠的CFbs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。從差異基因表達(dá)的熱圖數(shù)據(jù)（圖4A）可以看出ISO對(duì)各品系小鼠的CFbs轉(zhuǎn)錄組的影響是獨(dú)特的。另外，對(duì)比心肌纖維化以及增殖相關(guān)的基因可以發(fā)現(xiàn)，KK/HIJ品系中CFbs的激活和纖維化相關(guān)的基因與C3H/HeJ和C57BL/6J 品系相比高度上調(diào)（圖4B），而這三個(gè)品系中與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的基因的表達(dá)水平相似（圖4C）。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證心肌纖維化進(jìn)程中CFBs的激活和增殖不是相互包容的，CFbs增殖可能是CFbs激活的獨(dú)立反應(yīng)，不應(yīng)將CFbs的增殖作為心臟纖維化程度的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。
 

圖4. ISO處理可誘導(dǎo)不同品系小鼠CFbs的特異基因表達(dá)模式

最后，作者試圖在不同遺傳背景的小鼠品系中識(shí)別出與纖維化相關(guān)的共有特定基因作為纖維化的標(biāo)志物。作者聚焦于ISO處理后每個(gè)品系都上調(diào)的基因，可以觀察到絕大多數(shù)上調(diào)的基因?qū)γ總�(gè)品系都是獨(dú)特，而三者共同上調(diào)的重疊基因僅有9個(gè)（圖5A），并最終鎖定其中的LTBP2（圖5B）。作者對(duì)LTBP2進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)相同的增長趨勢(shì)（圖5C）。同時(shí)為了進(jìn)一步證實(shí)LTBP2蛋白在纖維化中存在，對(duì)ISO處理后的心臟切片進(jìn)行免疫組化，可以觀察到 LTBP2與成纖維細(xì)胞標(biāo)記物DDR2和αSMA共同定位，LTBP2的表達(dá)特異性地定位于纖維化區(qū)域，即使在心肌纖維化程度最小的C57BL/6J小鼠中也是如此（圖5D）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LTBP2的表達(dá)可能指示了心肌纖維化的發(fā)展，但其在纖維化中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。
 

圖5. 所有品系小鼠心肌纖維化后CFbs中的Ltbp2均上調(diào)

總之，本研究作者通過使用多個(gè)近交系小鼠品系來描述CFbs及其對(duì)ISO處理后的反應(yīng)，強(qiáng)調(diào)了遺傳背景特異性對(duì)于心肌纖維化的重要性。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明CFbs的激活，而不是增殖，與心肌纖維化嚴(yán)重程度密切相關(guān)。此外，通過比較多個(gè)品系的CFbs轉(zhuǎn)錄組，作者確定了LTBP2基因作為纖維化的標(biāo)志物，該基因與心肌纖維化密切相關(guān)，并指出可將其及其信號(hào)通路作為心肌纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。