繼前面介紹中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院赫捷院士團隊2021年6月21日在Nature Communications（IF=14.919）上發(fā)表“METTL3 promotes tumour developmentby decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding”的食管鱗癌 m6A機制文章后，本期我們繼續(xù)為大家介紹赫捷院士團隊 2021 年 5 月 8 日在 Nature 旗下期刊 Cell Death & Disease（IF=8.47）上發(fā)表的題為 “WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis” 的肺腺癌 m6A機制文章。該研究揭示了一種 Wnt/β-catenin 介導的 FTO 下調(diào)的關(guān)鍵機制，并凸顯了 MYC mRNA 的 m6A 修飾在調(diào)節(jié)腫瘤細胞糖酵解和生長中的作用。云序生物有幸參與了兩次研究當中的m6A MeRIP-seq和RNA-seq的測序服務(wù)以及生信分析。

發(fā)表期刊：Cell Death & Disease
發(fā)表日期：2021年5月8日
影響因子：8.47
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP、Co-IP 實驗等
文章鏈接：WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis  
一、FTO表達下調(diào)可促進肺腺癌（Lung Adenocarcinoma）的生長和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)TO 下調(diào)越嚴重，病患的生存率越低
作者首先從 TCGA 的公開數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中的 FTO 表達水平低于鄰近的正常組織，然后對 FTO 的 mRNA 進行 qPCR 實驗，驗證了這種表達差異的存在。免疫組化染色實驗也證實 FTO 的的表達水平在肺腺癌組織中要低于鄰近的正常組織。Kaplan-Meier 分析顯示，低 FTO 表達水平的病患擁有較低的總生存率。
在人類肺腺癌細胞系中對 FTO 的 mRNA 的敲降實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 表達的降低可顯著增強細胞的增殖以及非錨定依賴性生長（Anchorage-independed growth）的能力，細胞周期的速度也更快，細胞遷移和侵入性也更強。在體內(nèi)實驗方面，若將 FTO 敲降的細胞系注入無胸腺裸鼠的尾靜脈內(nèi)，相比于注入未敲降細胞的對照組，F(xiàn)TO 敲降的實驗組中的腫瘤細胞有明顯地向肺部轉(zhuǎn)移。
上述發(fā)現(xiàn)都指向一個結(jié)論：FTO 在肺腺癌細胞中的下調(diào)促進了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
 
二、Wnt 信號通路提高了 FTO 啟動子區(qū)的組蛋白 H3K27me3 甲基化，從而抑制 FTO 的表達
肺腺癌細胞中的 FTO 的表達是因為什么原因而下調(diào)的呢？為了回答這個問題，作者用 PROMO 軟件分析 FTO 基因的啟動子序列，在其中找到了 3 個有可能是 TBE 元件（LEF/TCF-binding element）的區(qū)域。為了驗證生信預(yù)測的真實性，作者又進行了了一系列分子生物學實驗。首先，ChIP 實驗證實了 TCF4 與 FTO 啟動子的結(jié)合。另外，熒光素酶報告基因的結(jié)果顯示，β-catenin 也可通過結(jié)合前述的 3 個 TBE 元件來抑制 FTO 啟動子。因此，β-catenin/LEF/TCF 復合體被證明可以抑制 FTO 啟動子的活性。人類肺腺癌細胞系經(jīng)過 Wnt 處理后，F(xiàn)TO 的 mRNA 和蛋白表達水平均有所降低，并且這種現(xiàn)象可通過敲降 β-catenin 來逆轉(zhuǎn)。綜合前面的幾個發(fā)現(xiàn)可以證明：Wnt 在信號通路的上游，通過誘導 β-catenin，使得β-catenin/LEF/TCF 復合體結(jié)合到 FTO 啟動子上，最終抑制了 FTO 的表達。
那么，Wnt 信號通路到底是怎么抑制 FTO 啟動子的呢？作者通過ChIP 實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 基因啟動子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域附近的組蛋白存在 H3K27me3 的甲基化修飾現(xiàn)象。學界在先前的研究中已經(jīng)知曉，EZH2 是一種負責組蛋白 H3K27me3 甲基化修飾的酶。通過Co-IP 實驗發(fā)現(xiàn)，Wnt 刺激可以促進 EZH2 與 β-catenin 的結(jié)合；通過 ChIP 實驗發(fā)現(xiàn)，Wnt 刺激也可以促進 EZH2 與 TBE 元件的結(jié)合。并且，敲降 EZH2 可阻斷 Wnt 對 FTO 表達的抑制作用。綜合前面的幾個發(fā)現(xiàn)可以證明：Wnt 信號誘導了 EZH2 與 β-catenin 的結(jié)合，導致了 FTO 啟動子附近的組蛋白發(fā)生 H3K27me3 甲基化修飾，從而抑制 FTO 表達。
  三、FTO 表達下調(diào)可提高 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平，從而促進 c-Myc 的表達
在肺腺癌細胞當中，哪些 RNA 會受 FTO 表達下調(diào)的調(diào)控，進而引發(fā)肺腺癌呢？為了探明 FTO 下游的分子致病原因，作者進行了 m6A 甲基化測序，發(fā)現(xiàn) FTO 敲降的肺腺癌細胞當中有大量基因的 mRNA m6A 甲基化上調(diào)。FTO 是一種典型的 RNA m6A 甲基化的去修飾酶（也就是 m6A 的 “Eraser”），可以消去 m6A 甲基化，還原出普通的 A 堿基。通過云序生物m6A MeRIP-seq發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO敲降細胞中有 556 個基因的 mRNA的 m6A 修飾水平升高；生信分析也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 敲降細胞的代謝通路當中有許多基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高，其中就包括一個重要的轉(zhuǎn)錄因子 MYC。m6A MeRIP-seq的結(jié)果可以驗證，當敲降了 FTO 之后，MYC 基因的 mRNA 的終止密碼子附近的 m6A 修飾水平升高。通過云序生物m6A MeRIP-qPCR 實驗 結(jié)果也證實，F(xiàn)TO 的敲降可以提升 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。針對 FTO 蛋白的 RIP 實驗更是直接證明，F(xiàn)TO 結(jié)合在 MYC 的 mRNA 上面。綜合前面的幾個發(fā)現(xiàn)可以證明，F(xiàn)TO 可結(jié)合 MYC 的 mRNA，從而降低 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。
那么，c-Myc 蛋白的表達水平又是如何受到調(diào)控的呢？作者設(shè)計了熒光素酶報告基因，將熒光素酶報告基因插入 MYC 的 mRNA 中，并將實驗組的 mRNA 3’ 端的 m6A 突變?yōu)槠渌鼔A基，對照組的 MYC mRNA 則不做任何堿基修飾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 敲降后，對照組的 MYC mRNA 表達了大量熒光素酶，但經(jīng)過堿基突變而不再具有 m6A 的實驗組則沒有熒光素酶信號，說明 MYC 的 mRNA 3’ 端的 m6A 對于蛋白的成功翻譯不可或缺。相反地，如果過表達 FTO，那么肺腺癌細胞系的 c-Myc 蛋白的表達量會下降。但是，無論是 FTO 敲降還是過表達，MYC 的 mRNA 水平都沒有改變。綜上可知，c-Myc 蛋白表達量的變化，與 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平正相關(guān)，而與 MYC mRNA 的表達水平無關(guān)。
 
四、YTHDF1 通過結(jié)合 m6A 修飾的 MYC mRNA 來促進其翻譯
既然 FTO 敲降所導致的 c-Myc 蛋白的表達水平上升并不是由 MYC mRNA 表達水平的變化造成的，那么造成這一現(xiàn)象的原因會是什么呢？會不會是 mRNA 翻譯調(diào)控呢？YTHDF1 是一種典型的 RNA m6A 甲基化識別蛋白（也就是 m6A 的 “Reader”）。用 anti-YTHDF1 抗體進行RIP實驗，發(fā)現(xiàn) FTO 的敲降將會增強 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結(jié)合。雖然敲降 YTHDF1 并沒有影響 MYC mRNA 的表達水平，但卻能降低 c-Myc 蛋白的表達水平。在上一段中發(fā)現(xiàn)的 FTO 的敲降所導致的 c-Myc 蛋白表達水平的上升，還會被 YTHDF1 的敲降所逆轉(zhuǎn)，說明 YTHDF1 發(fā)揮功能的位置在 FTO 的下游和 c-Myc 的上游 。綜上可知，F(xiàn)TO 表達下調(diào)所導致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識別并結(jié)合，從而促進 MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
五、FTO 表達下調(diào)所誘導的 c-Myc 表達，可促進肺腺癌細胞的糖酵解、生長、遷移、侵入和腫瘤發(fā)生
c-Myc 蛋白在癌癥的代謝當中扮演重要的角色，因此作者就 c-Myc 的高表達在肺腺癌當中所發(fā)揮的作用進行了進一步的研究。首先，在小鼠肺腺癌細胞系中，F(xiàn)TO 敲降的細胞表現(xiàn)出己糖激酶-2（HK2） mRNA 和蛋白高表達的現(xiàn)象，說明 FTO 敲降細胞的糖酵解活躍。并且，F(xiàn)TO 敲降誘導的 HK-2 高表達現(xiàn)象，可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)，說明 c-Myc 發(fā)揮功能的位置在 FTO 的下游和己糖激酶的上游。類似地，F(xiàn)TO 敲降細胞的葡萄糖攝取、乳糖生成、細胞增殖、細胞遷移、細胞侵入能力等均有升高，且這些升高現(xiàn)象均可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)。
作者進一步進行了體內(nèi)實驗：在無胸腺裸鼠體內(nèi)，注入 FTO 敲降的肺腺癌細胞系可以促進腫瘤生長，且該生長促進的現(xiàn)象可被 c-Myc 的敲降所逆轉(zhuǎn)。免疫組化染色實驗發(fā)現(xiàn)，在注入了 FTO 敲降細胞的腫瘤組織當中，c-Myc、HK-2 以及 Ki67（一種細胞增殖的標志物）均有高表達，且該現(xiàn)象可被 c-Myc 敲降所逆轉(zhuǎn)。此外，注入了 FTO 敲降細胞的裸鼠發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移，且這種轉(zhuǎn)移可被 c-Myc 敲降所抑制。綜合前面的幾個發(fā)現(xiàn)可以證明：FTO 表達下調(diào)所誘導的 c-Myc 表達，可在小鼠體內(nèi)促進肺腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。
   

在本研究當中，作者發(fā)現(xiàn)：

• 肺腺癌組織當中，m6A 的去修飾化酶 FTO 的表達水平存在下調(diào)。
• Wnt 信號誘導的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復合體結(jié)合于 FTO 基因啟動子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域，通過組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉(zhuǎn)錄。
• 通過m6A MeRIP-seq發(fā)現(xiàn)FTO 的表達下調(diào)使得包含 MYC 在內(nèi)的多種代謝相關(guān)基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高。
• MYC mRNA 的 m6A 修飾可以募集 m6A 識別蛋白 YTHDF1 的結(jié)合，從而促進 c-Myc 蛋白的翻譯表達，進而提升腫瘤細胞的糖酵解水平和細胞增殖能力，促進腫瘤發(fā)生。

 

本篇論文體現(xiàn)了從酶出發(fā)研究 RNA 的 m6A 修飾的一種經(jīng)典研究思路。
首先，作者發(fā)現(xiàn)了肺腺癌當中 m6A 去修飾化酶 FTO 的異常低表達，就此選定 FTO 這個酶為研究對象。緊接著，作者敲降 FTO 以控制變量，以研究 FTO 這個酶在肺腺癌中所發(fā)揮的功能。下一步，作者從上游和下游兩個方向篩選出與 FTO 基因或 FTO蛋白發(fā)生互作的分子：一方面，通過一系列Co-IP、ChIP 和熒光素酶報告實驗，作者證明 FTO 基因是 Wnt 信號通路的靶基因，Wnt 誘導的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復合體結(jié)合于 FTO 基因啟動子區(qū)域的 TBE 元件區(qū)域，通過組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面，通過m6A MeRIP-seq 和生信預(yù)測，作者篩選出 MYC 作為 FTO 蛋白的靶基因，并通過一系列的MeRIP-qPCR、RIP 和熒光素酶報告實驗，證明 c-Myc 蛋白的表達量是跟隨 FTO 蛋白表達量變化的因變量。
在研究了 FTO 對肺腺癌的作用機制的基礎(chǔ)上，作者還進一步探索了 m6A 識別蛋白 YTHDF1 在肺腺癌中扮演的角色。首先，通過 RIP實驗，作者證明了 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結(jié)合。隨后，通過結(jié)合 FTO 敲降和 YTHDF1 敲降實驗的結(jié)果，證明 FTO 表達下調(diào)所導致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識別并結(jié)合，從而促進 MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
在本研究當中，肺腺癌致病機理當中的 “Eraser” 和 “Reader” 都得到了闡釋。這些新發(fā)現(xiàn)對于肺腺癌的治療提供了一種全新的潛在思路。