Master Cell Cryopreservation
掌握細(xì)胞凍存

 

做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候?yàn)槭裁匆�進(jìn)行細(xì)胞凍存呢？

細(xì)胞凍存有哪些好處呢？

01 節(jié)省實(shí)驗(yàn)室空間、時(shí)間、經(jīng)費(fèi)
02 若實(shí)驗(yàn)失敗，還有重來的機(jī)會(huì)
03 確保重復(fù)實(shí)驗(yàn)的一致性
04 確保未來實(shí)驗(yàn)的連貫性

但是，經(jīng)常會(huì)有用戶反映，細(xì)胞凍存與復(fù)蘇遇到了問題，看來看似簡(jiǎn)單的一步其實(shí)并不簡(jiǎn)單。
那么如何做好細(xì)胞凍存呢？今天跟隨我們一起來了解一下細(xì)胞凍存時(shí)需要注意的事項(xiàng)和技巧吧。
 

細(xì)胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環(huán)境溫度低于-70℃時(shí)會(huì)集體罷工，低溫貯藏的目的是通過超低溫使代謝活動(dòng)近乎停止。細(xì)胞因此進(jìn)入休眠狀態(tài)，使細(xì)胞“不會(huì)老”，可以長(zhǎng)期保存。
因?yàn)閮鋈谶^程對(duì)所有細(xì)胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發(fā)出有效的技術(shù)來防止細(xì)胞死亡和損傷。

Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).

這時(shí)，低溫保護(hù)劑就發(fā)揮出它的作用了。
低溫保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞內(nèi)冰凍影響，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護(hù)劑。它們的作用機(jī)制包括：自由進(jìn)入細(xì)胞，取代水，使冰點(diǎn)下降，充當(dāng)鹽的二次溶劑，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。如下圖所示：

但是，部分低溫保護(hù)劑在緩慢冷凍過程中雖然會(huì)保護(hù)細(xì)胞，但它們也會(huì)引起細(xì)胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中，會(huì)含有血清，血清是用來降低細(xì)胞毒性的，但血清也不是完美的。

那么有無動(dòng)物源成分替換物嗎？
甲基纖維素已被認(rèn)為是細(xì)胞冷凍保存的保護(hù)劑，可作為胎牛血清的合適替代物。
1. 化學(xué)成分明確
2. 保護(hù)性

甲基纖維素結(jié)構(gòu)圖

Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE.

盡管大多數(shù)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都存在優(yōu)化的冷凍保存方案和已發(fā)表的配方，但技術(shù)問題依然存在。
 

 Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.
 

首先我們需要明確首要任務(wù)是什么？我們的細(xì)胞需要什么？
l   回收率？
l   存活率？
l   低溫保存培養(yǎng)基成分？
l   無血清或無外源性要求？
l   我需要使用哪個(gè)方法？
l   商業(yè)培養(yǎng)基相比于自制培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)？


Biological Industries推出了一種即用型，無動(dòng)物源成分的凍存液：

下圖為NutriFreez^® D10凍存液適用的細(xì)胞類型：

Biological Industries使用人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）、人多能干細(xì)胞（hPSC）和一些其他的細(xì)胞系對(duì)NutriFreez^® D10凍存液進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：
 

Biological Industries使用NutriFreez^® D10凍存液與市面上其他兩種凍存液對(duì)hMSC細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及存活率進(jìn)行了比較：

存活率                                                      細(xì)胞數(shù)量對(duì)比
 

細(xì)胞形態(tài)
 

如圖所示，用NutriFreez^® D10冷凍保存的hMSC復(fù)蘇當(dāng)天的存活率為95%；復(fù)蘇后3天的細(xì)胞數(shù)量增加超過7倍，細(xì)胞在生長(zhǎng)3天后比其他產(chǎn)品更好的恢。

我們比較了用D10凍存液和另外兩種凍存液凍存的人間充質(zhì)干細(xì)胞，復(fù)蘇后的細(xì)胞增殖狀況和形態(tài)。對(duì)比可知，D10凍存液凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后具有更高的細(xì)胞密度和正常的細(xì)胞形態(tài)。

1.hMSC低溫保存復(fù)蘇后的增殖和形態(tài)比較：

hMSC-BM（左圖）；hMSC-AT（右圖）
如圖，是人間充質(zhì)干細(xì)胞在D10凍存液中凍存不同時(shí)間，復(fù)蘇后的存活率比較。從結(jié)果可以看出，人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞在D10凍存液中冷凍保存3年后相比于保存一年半仍然具有很高的存活率。

2. 各種hMSC在NutriFreez^®  D10培養(yǎng)基中低溫保存復(fù)蘇后的存活率比較：

接下來是各種人間充質(zhì)干細(xì)胞在用D10凍存液凍存，復(fù)蘇后的存活率比較�？梢妬碜灾�肪組織（AT）、骨髓（BM）和牙髓（DP）的間充質(zhì)干細(xì)胞，復(fù)蘇當(dāng)天與復(fù)蘇3天后的存活率沒有明顯差異。

3. 不同類型hMSC在NutriFreez^® D10培養(yǎng)基中低溫保存后的形態(tài)比較：

如圖所示，是各種人間充質(zhì)干細(xì)胞在D10凍存液中凍存復(fù)蘇后的形態(tài)比較。脂肪（AT）、骨髓（BM）和牙髓（DP）來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，復(fù)蘇當(dāng)天與復(fù)蘇3天后的形態(tài)均正常。

4. 表面標(biāo)志物表達(dá)分析：

多種人間充質(zhì)干細(xì)胞用D10凍存液凍存，復(fù)蘇后，通過流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)分析，依然保持表面標(biāo)志物表達(dá)。

5. hMSC細(xì)胞的存活率的比較：

通過臺(tái)盼藍(lán)排除和膜聯(lián)蛋白V / PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分析對(duì)自制和其他品牌凍存液凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后活力比較。與自制和競(jìng)爭(zhēng)品牌相比，用D10凍存液凍存的原代人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后表現(xiàn)出最佳的存活率，此外還提高了細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)性能。

6. 在解凍后6天細(xì)胞復(fù)蘇率對(duì)比：

相比之下，在NutriFreez^® D10凍存液中保存的原代人間充質(zhì)干細(xì)胞（來自健康供體）在解凍后的回收率最高，此外還提高了細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)性能。復(fù)蘇后第6天表現(xiàn)出最佳的復(fù)蘇率。

人多能干細(xì)胞（hPSC）

如圖所示，人多能干細(xì)胞在NutriFreez^® D10培養(yǎng)基中低溫保存復(fù)蘇后表現(xiàn)出更好的恢復(fù)和形態(tài)。

細(xì)胞克隆效果顯著，細(xì)胞集落形態(tài)正常，表現(xiàn)出更好的復(fù)蘇效果。

2. 分化潛能分析：

利用 hematoxylin -伊紅染色法對(duì)自發(fā)形成的18天后的胚狀體進(jìn)行組織學(xué)切片染色鑒別人胚胎干細(xì)胞。hPSC在D10凍存液凍存，復(fù)蘇后仍能保持多項(xiàng)分化潛能。

3. 單細(xì)胞附著能力分析：

用D10凍存液凍存，復(fù)蘇后觀察單細(xì)胞復(fù)蘇，形態(tài)和附著。ACS-1019細(xì)胞和附著能力強(qiáng)。

4. 標(biāo)志物表達(dá)：
 

在不影響人胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇后未分化狀態(tài)和膨脹率的情況下，驗(yàn)證性研究用D10凍存液適當(dāng)?shù)蜏貎龃嫒硕嗄芨杉?xì)胞的能力。未分化的人多能干細(xì)胞中Oct3/4和SSEA4標(biāo)志物表達(dá)超過85%。

5. 驗(yàn)證性研究
在不影響hPSC解凍后未分化狀態(tài)和膨脹率的情況下，低溫保存hPSC的能力。

核型分析分辨率為500-550條帶時(shí)未檢測(cè)到克隆異常，這是正常的核型。
研究證實(shí)，使用D10凍存液凍存的hPSC，復(fù)蘇后細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)或核型沒有受到影響。D10凍存液符合WiCell干細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)量要求，當(dāng)按照指導(dǎo)使用時(shí)，適合用于hPSC的低溫保存。
 

原代及多種細(xì)胞系的驗(yàn)證
 

 

 

與在自制凍存液凍存的細(xì)胞相比，用D10凍存液凍存的外周血單核細(xì)胞，復(fù)蘇后的存活率高達(dá)91%。

2. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：

 

用D10凍存液凍存，復(fù)蘇后表現(xiàn)出94%的存活率和較高的細(xì)胞產(chǎn)量，復(fù)蘇第4天后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常。
 

用抗內(nèi)皮細(xì)胞表面CD31、CD144和CD90的抗體標(biāo)記臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞并用D10凍存液凍存，復(fù)蘇后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，依然維持表面標(biāo)記物的表達(dá)。

3. 人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞：

存活率                                      細(xì)胞形態(tài)

人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞用D10凍存液凍存，復(fù)蘇后存活率高達(dá)96%。復(fù)蘇后第4天保持正常細(xì)胞形態(tài)。

4. 多種細(xì)胞系不同時(shí)長(zhǎng)存活率比較：

多種細(xì)胞系用D10凍存液凍存不同時(shí)長(zhǎng)，復(fù)蘇后的存活率比較，相比凍存6個(gè)月，凍存4年的細(xì)胞復(fù)蘇率略有下降，但依然處于較高水平。

5. 多種細(xì)胞系存活率及貼壁率比較：

 

據(jù)圖可知，不同細(xì)胞系的貼壁率和存活率有明顯差異；同一種細(xì)胞系，用D10凍存液凍存比用自制凍存液凍存，復(fù)蘇后的貼壁率和存活率更高，意味著D10凍存液具有更好的凍存效果。
 

Biological Industries同時(shí)也委托WiCell做了相關(guān)驗(yàn)證測(cè)試。
WiCell---One of the leading hESC cell banks in the United States
WiCell測(cè)試表明在不影響未分化狀態(tài)和解凍后擴(kuò)增速率的情況下，用NutriFreez^® D10凍存液凍存的人多能干細(xì)胞在細(xì)胞的增殖、分化、形態(tài)及核型無影響。
 

 

低溫凍存技巧
 

冷凍凝固的過程中，水分子會(huì)在0℃~-20℃區(qū)間形成不同形狀的結(jié)晶。
 

在細(xì)胞凍存時(shí)“降溫速度、冰晶形成量和細(xì)胞滲透壓改變程度”是影響凍存成功的關(guān)鍵因素。
降溫速度慢：冰晶由細(xì)胞外開始形成，造成胞外滲透壓變小，細(xì)胞內(nèi)水分移動(dòng)至細(xì)胞外造成細(xì)胞脫水。
降溫速度快：水分流動(dòng)時(shí)間短，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變程度小，但大量水分留在細(xì)胞內(nèi)造成大量胞內(nèi)冰晶形成，使得胞器損壞。
 

 

這些影響都會(huì)讓細(xì)胞損傷、凋亡或壞死，也可能造成復(fù)蘇后細(xì)胞存活率低、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞功能喪失、基因變異等現(xiàn)象。


由此可知，最適合的凍存條件為“在增加細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定性的溶液中，以慢到能減少胞內(nèi)冰晶形成，但也足夠快到能預(yù)防細(xì)胞脫水的降溫速度凍存細(xì)胞”。
 

慢凍快融

慢凍→兩種辦法：
手動(dòng)降溫：將細(xì)胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時(shí)）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱），使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。
 

 

由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動(dòng)降溫。
大家可以根據(jù)自身情況或者實(shí)驗(yàn)條件選擇不同的凍存方式。

快融：
將凍存在液氮中的細(xì)胞凍存管快速移至已37℃預(yù)熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進(jìn)入凍存管造成潛在污染），使細(xì)胞冷凍懸液迅速融化，此做法能讓細(xì)胞冷凍懸液快速通過-20℃~0℃這個(gè)結(jié)晶形成溫度范圍，避免冰晶進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成二次傷害。

FAQ：

References 
1.  B. Liu, et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-23320-8. 
2.  N. Aydoğdu, et al. Isolation, Culture, Cryopreservation, and Preparation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells as a Final Cellular Product Under Good Manufacturing Practices–Compliant Conditions. Methods in Molecular Biology. (2020) Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/7651_2020_332. 
3.  R. E. Burnham, et al. Human serum albumin and chromatin condensation rescue ex vivo expanded γδ T cells from the effects of cryopreservation. Cryobiology, 2021, ISSN 0011-2240, https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2021.01.011.
4.  S. Reichman, et al. Compositions and Methods for Efficient Amplification of Retinal Progenitors Cells. US Patent App. 16/976581, 01/07/2021. 
 

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