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誘導多能干細胞IPS的操作方法和注意事項

瀏覽次數(shù):1535 發(fā)布日期:2021-9-13  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells)簡稱 IPS細胞,iPS細胞是將一些多能遺傳基因導入皮膚等細胞中制造而成。讓普通體細胞“初始化”,使其具備干細胞功能,這就是“iPS細胞”。


                   


“iPS細胞”不僅在細胞形態(tài)、生長特性,干細胞標志物表達等方面與ES細胞非常相似,而且在DNA甲基化方式、基因表達譜、染色質狀態(tài)、形成嵌合體動物等方面也與ES細胞(胚胎干細胞)幾乎完全相同。  其操作的方法如下:
一、復蘇
1、事先用Matrix進行培養(yǎng)皿/板的包被處理。平時Matrix保存在-20℃,使用之前放在4℃冰箱或冰上進行解凍。待Matrix解凍后,按1:100的比例迅速用PBS液體稀釋。按6孔板每孔加1ml,150px皿加2ml,250px皿加3ml的量加入,加入后迅速搖動皿/板,使加入的Matrix完全覆蓋整個皿底。放到37℃培養(yǎng)箱中4小時,使用前去掉包被液(如果暫時不使用,用封口膜密封,在4℃冰箱能保存一周)。
2、復蘇前準備iCell解凍完全培養(yǎng)基(iCell解凍液基礎培養(yǎng)基以及iCell解凍液添加劑)。加入適量的解凍液(6孔板每孔加2ml,150px皿加3ml,250px皿加9ml),另加入10ug/ml的Y27632因子,放入37℃培養(yǎng)箱中。
3、復蘇一支細胞用5ml的上述混合培養(yǎng)基,復蘇之前要在37℃水浴鍋里充分預熱。從液氮罐里取出凍存管后,迅速轉移到生物安全柜中(如果液氮罐的位置距離安全柜遠,要用裝有液氮的容器把凍存管轉移到安全柜),并用加熱好的完全培養(yǎng)基進行解凍(用移液槍不停的往凍存管中打入—抽出培養(yǎng)基,交換溶解開的細胞,直至完全溶解)。
4、200Xg離心5分鐘,去掉上清液,加入1ml的iCell完全解凍培養(yǎng)基(含10ug/ml的Y27632因子),用手指彈碎管內沉淀。按接種到每孔板/皿1ml的量,補充iCell完全解凍培養(yǎng)基到離心管中,輕輕吹吸三四次后加入培養(yǎng)皿/板中。水平十字振動使細胞均勻分布,5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
5、24小時后換成iCell完全培養(yǎng)基(iCell基礎培養(yǎng)基以及iCell基礎培養(yǎng)基添加劑)。以后每隔22—24小時換液。細胞長滿80-90%需要傳代或凍存。

二、傳代/凍存
1、傳代前要進行培養(yǎng)皿/板的包被處理,做法與復蘇時相同。培養(yǎng)基為iCell完全培養(yǎng)基,同時加入10ul/ml的Y27632因子。
2、傳代/凍存前,準備37℃預熱好的無鈣鎂離子PBS溶液及傳代工作液(0.5mM EDTA+0.025%胰酶)。
3、吸走iCell完全培養(yǎng)基,并加入37℃預熱好的PBS溶液清洗二次。
4、加入適量(按6孔板每孔加1ml,150px皿加2ml,250px皿加3ml的量)的37℃預熱好的傳代工作液。
5、37℃放置4-5分鐘(前一分鐘過后拿出來,用手指輕彈幾下板/皿的底部),顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底,克隆內部大部分細胞間出現(xiàn)間隙但尚未相互分離,肉眼觀察到細胞集落變得不透明且發(fā)白,表明細胞消化時間理想。
6、迅速吸去傳代液,加入適量的iCell完全培養(yǎng)基終止消化,用移液器扇形吹打皿/板底部(吹打不用超過10次),使附著的細胞集落脫落。(如果消化時間不當,致使細胞完全從皿/板底剝離的情況,不用吸出傳代液,加入同等量的iCell完全培養(yǎng)基終止消化)。
7、移入離心管,離心后重懸。傳代比例為1:8—1:12;凍存按6孔板每孔凍1支,150px皿凍2-4支,250px皿凍6-12支。每支加入0.8ml的90%iCell完全培養(yǎng)基與10%的DMSO。
8、復蘇時按凍存前的1:4—1:6的比例進行。


            

注意事項:
1、每次換液時要觀察細胞生長狀況以及細胞形態(tài)的變化并對細胞進行拍照,但是在培養(yǎng)箱外操作的時間不要過長,避免因溫度對細胞生長狀態(tài)造成不利影響。
2、更換培養(yǎng)基之前,要對新的培養(yǎng)基進行37℃預熱。為了避免反復加熱培養(yǎng)基而造成的培養(yǎng)基中各種成分的影響,只對本次要更換的量進行預熱處理。
3、用移液器吹打細胞,因為移液管的端部較為圓滑,對細胞傷害的程度小于用1ml的槍。
4、細胞密度達到80-90%時要及時傳代,否則會造成細胞形態(tài)的變化。但是,如果細胞在鋪板時混合不均勻,而形成部分集落過大的情況,即使沒有達到80-90%也要進行傳代。

來源:上海博湖生物科技有限公司
聯(lián)系電話:021-57763112
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