我們?cè)陂_(kāi)展異源基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，常常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題，就是異源基因在宿主細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量很低。疑惑的是所表達(dá)的蛋白既不是毒蛋白，且所用的也是強(qiáng)啟動(dòng)子，那為什么還會(huì)出現(xiàn)這種問(wèn)題呢？這時(shí)候我們可以考慮是不是存在密碼子偏好性的問(wèn)題，可以通過(guò)密碼子優(yōu)化來(lái)提高異源基因在宿主細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量。

什么是密碼子的偏好性
密碼子的偏好性是指不同生物在翻譯過(guò)程中對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的使用頻率存在差異，而在進(jìn)化的過(guò)程中形成了一套與其相適應(yīng)的常用密碼子。蛋白質(zhì)在翻譯的過(guò)程中，是由tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸至核糖體中，mRNA中的三聯(lián)體密碼決定氨基酸序列（圖1）。由于密碼子存在簡(jiǎn)并性，因此同一種氨基酸可以由多個(gè)密碼子編碼。這意味著有61種可能的tRNA，而在生物體中都表達(dá)61種tRNA的可能性不高，并且每種tRNA的表達(dá)豐度也會(huì)存在差異。那當(dāng)外源基因的密碼子所對(duì)應(yīng)的tRNA在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量低時(shí)，則會(huì)影響它的翻譯效率。
 

圖1. 肽鏈的合成過(guò)程（Image from Mariana Ruiz Villarreal）

什么是密碼子優(yōu)化
密碼子優(yōu)化是通過(guò)基因工程技術(shù)，根據(jù)宿主的密碼子偏好性調(diào)整基因的同義密碼子，達(dá)到消除稀有密碼子的目的，并且優(yōu)化如mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和Motif等相關(guān)參數(shù)，從而提高翻譯效率。當(dāng)異源基因在宿主中無(wú)法有效表達(dá)時(shí)，可以考慮進(jìn)行密碼子優(yōu)化，調(diào)整同義密碼子和相關(guān)的調(diào)控元件，提高翻譯效率。通過(guò)這種方法提高異源基因翻譯效率的報(bào)道已經(jīng)很多。如為了在人胚胎腎細(xì)胞（HEK293T）中提高重組豬白細(xì)胞介素-7（pIL-7）的表達(dá)，崔丹等依據(jù)人密碼子的偏好對(duì)pIL-7基因進(jìn)行了優(yōu)化修飾，結(jié)果顯示，密碼子優(yōu)化后pIL-7基因在HEK293T細(xì)胞中的表比野生型pIL-7基因的表達(dá)水平提高了2倍多，可見(jiàn)密碼子優(yōu)化可明顯提高重組pIL-7在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)[1]。
 

圖2. 密碼子優(yōu)化型IL-7基因表達(dá)水平與其野生型基因的比較[1]

密碼子優(yōu)化需考慮的因素
密碼子優(yōu)化需要綜合考慮多種因素，才能取得良好的優(yōu)化效果。不是簡(jiǎn)單地將外源基因的同義密碼子調(diào)整為宿主細(xì)胞中表達(dá)豐度高、使用頻率高的密碼子就能提高蛋白的翻譯效率，有時(shí)候效果往往會(huì)適得其反。因此密碼子優(yōu)化并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)。下面我們介紹密碼子優(yōu)化時(shí)需要注意的主要因素：

1. 用宿主中最相似頻率的同義密碼子替換原序列密碼子。如上述所言，生物體翻譯過(guò)程中存在密碼子的偏好性，若是在基因的同義密碼子使用頻率與表達(dá)宿主相匹配的情況下，蛋白的表達(dá)水平則會(huì)顯著提高。匹配程度常用密碼子適應(yīng)指數(shù) （Codon Adaption Index，CAI）來(lái)表示，通常情況下，CAI≥0.80被認(rèn)為是預(yù)測(cè)重組蛋白高效表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。并且在設(shè)計(jì)時(shí)要避免連續(xù)兩個(gè)以上稀有密碼子同時(shí)存在，否則很可能會(huì)導(dǎo)致翻譯效率急劇降低，甚至可能會(huì)終止肽鏈的合成。

2. mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯效率具有一定的影響。當(dāng)mRNA因其序列而形成復(fù)雜穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)降低翻譯效率。尤其是序列里有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)或翻譯起始位點(diǎn)互作的序列，會(huì)阻止翻譯的進(jìn)行，合理優(yōu)化翻譯起始區(qū)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，將有效提高目的蛋白表達(dá)水平。

3. 避開(kāi)某些限制性酶切位點(diǎn)。在密碼子優(yōu)化時(shí)避免形成構(gòu)建載體時(shí)所需要的酶切位點(diǎn)，以免酶切位點(diǎn)產(chǎn)生沖突，影響構(gòu)建表達(dá)載體的操作。

4. GC含量要合適。GC含量能影響DNA的穩(wěn)定性，間接影響基因的表達(dá)調(diào)控，當(dāng)GC含量超過(guò)70%可能會(huì)降低蛋白的表達(dá)。

5. 調(diào)整Motif和剪切位點(diǎn)。如增強(qiáng)子、Shine-Dalgarno序列的特異核糖體結(jié)合序列、TATA box等順式作用原件能促進(jìn)或者抑制基因的表達(dá)量。因此調(diào)整相關(guān)Motif能提高蛋白的表達(dá)量。而去除內(nèi)含子屬性的剪接位點(diǎn)，也能提高蛋白表達(dá)成功率。

密碼子優(yōu)化的風(fēng)險(xiǎn)
密碼子優(yōu)化能夠提高蛋白質(zhì)的翻譯效率，從而提高蛋白的表達(dá)量。但是改變密碼子也可能產(chǎn)生潛在不利的影響，如密碼子優(yōu)化可能影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象、折疊和穩(wěn)定性等[2]。核糖體在肽鏈延伸的過(guò)程中可能減慢速度，不過(guò)這是肽鏈以正確折疊的重要步驟[3]。另外，不同的tRNA會(huì)影響翻譯的效率，這就可能影響核糖體對(duì)肽鏈的加工時(shí)間。

參考文獻(xiàn)：
[1]崔丹, 溫潔霞, 霍珊珊等. 密碼子優(yōu)化提高豬IL-7在HEK293T細(xì)胞表達(dá)的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 第40卷（6）:88-92.

[2]Mauro, Vincent P., and Stephen A. Chappell. “A Critical Analysis of Codon Optimization in Human Therapeutics.” Trends in Molecular Medicine, vol. 20, no. 11, 2014, pp. 604–613.

[3]Stadler, Michael, and Andrew Fire. “Wobble Base-Pairing Slows in Vivo Translation Elongation in Metazoans.” RNA, vol. 17, no. 12, 2011, pp. 2063–2073.

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