病毒載體包裝過(guò)程是復(fù)雜的，在做病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，科研工作者常遇到一些問(wèn)題。為了讓大家在病毒包裝這塊少走彎路，《細(xì)胞基因編輯小課堂欄目》特邀賽業(yè)生物細(xì)胞生物學(xué)產(chǎn)品經(jīng)理針對(duì)病毒包裝常見(jiàn)的問(wèn)題為大家進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)總結(jié)與心得分享。有同學(xué)留言說(shuō)想看腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）包裝，有求必應(yīng)的小賽這就安排上！
 

Q1：AAV有哪些特性呢？

Q2：實(shí)現(xiàn)AAV在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)需要注意哪些關(guān)鍵點(diǎn)？

1. 血清型的選擇。AAV的血清型主要由AAV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)所決定，不同的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)識(shí)別不同的細(xì)胞表面受體，因此血清型的選擇會(huì)影響AAV的感染效率、組織親和性、和開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間。

2. 啟動(dòng)子的選擇。是選擇廣譜性啟動(dòng)子還是特異性啟動(dòng)子。相比于血清型的組織特異性，特異性啟動(dòng)子可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的特異性，因此對(duì)特異性要求較高的研究，可以選擇某種細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。

3. 注射方式。對(duì)于可以進(jìn)行局部注射的組織器官，采用局部多點(diǎn)注射靶器官可取得較好的特異性和表達(dá)效果。

4. 病毒量及滴度。根據(jù)不同的靶器官組織和所使用的不同AAV血清型（擴(kuò)散能力不同），推薦注射的AAV量不同，傳遞到組織中的病毒顆粒數(shù)量對(duì)于感染效果影響很大。但AAV使用量并不是越多越好，過(guò)多的量可能出現(xiàn)病毒溢出，而且根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，病毒量太多有時(shí)候甚至?xí)�出現(xiàn)表達(dá)降低的情況。想了解具體組織的病毒用量可以聯(lián)系我們咨詢(xún)。

5. 檢測(cè)時(shí)間。不同基因的表達(dá)高峰時(shí)間是不同的，再加上AAV需要從單鏈DNA變成雙鏈DNA，一般在2周可檢測(cè)到基因表達(dá)，如無(wú)抗體產(chǎn)生的影響，基因的表達(dá)可持續(xù)表達(dá)半年以上。

Q3：為什么很少用AAV做細(xì)胞感染？
主要是因?yàn)锳AV轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)效率較低，且由于AAV是單鏈DNA，進(jìn)入細(xì)胞后須經(jīng)歷一個(gè)由單鏈變成雙鏈的過(guò)程才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯，而在沒(méi)有輔助病毒或輔助因子的情況下，這種單鏈DNA復(fù)制形成雙鏈DNA的過(guò)程十分緩慢，因此存在表達(dá)延遲的情況。

另外，體外細(xì)胞的生長(zhǎng)速率較快，感染至細(xì)胞中的AAV會(huì)隨著細(xì)胞分裂不斷稀釋?zhuān)�進(jìn)一步導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。而在體內(nèi)研究，注射的組織細(xì)胞通常不會(huì)有那么快的增殖，且各種AAV所攜帶的外源基因表達(dá)的因子較為豐富，因此表達(dá)豐度和持續(xù)的時(shí)間更好。

Q4：如何通過(guò)AAV實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的特異性表達(dá)？
由于目的基因在不同組織中功能不同，以及同一組織的不同細(xì)胞中功能也可能不同，所以我們實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常需要進(jìn)行特異性表達(dá)。AAV可通過(guò)以下幾種方式實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的特異性表達(dá)：
1. 組織特異性血清型。不同血清型的AAV具有不同的組織嗜性，因此首先要選擇對(duì)特定組織感染能力強(qiáng)的血清型AAV。

2.（細(xì)胞）特異性啟動(dòng)子。血清型主要利用侵染特異性，而啟動(dòng)子則是利用表達(dá)特異性，如某種特異性啟動(dòng)子AAV2，可侵染多種組織，但僅在某特定細(xì)胞表達(dá)。

3. 局部注射。此外還可采用Cre依賴(lài)性基因開(kāi)關(guān)（Cre-loxp系統(tǒng)），如用特異性啟動(dòng)子含cre酶的AAV注射Loxp小鼠實(shí)現(xiàn)特定組織或細(xì)胞目的基因的敲除。

Q5：AAV作為一種體內(nèi)常用的工具病毒，可實(shí)現(xiàn)什么功能？

1. 基因過(guò)表達(dá)。將目的基因的CDS區(qū)構(gòu)建到AAV載體，注射到動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)。
2. 基因干擾表達(dá)。將針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的shRNA構(gòu)建到AAV載體，注射到動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)干擾表達(dá)。
3. 目的基因的敲除。將針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的gRNA和Cas9編碼序列分別構(gòu)建到AAV中，注射到動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因敲除。
4. 內(nèi)源過(guò)表達(dá)。將針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的gRNA和dCas9分別構(gòu)建到AAV載體，實(shí)現(xiàn)內(nèi)源過(guò)表達(dá)。

Q6：AAV感染后熒光弱？
熒光弱主要有2方面的原因，一是組織感染的效率較差，另外就是檢測(cè)的正確性。對(duì)于提高感染效率，則從病毒血清型是否合適、病毒使用量是否夠、滴度是否合適，注射方法是否合理等方面進(jìn)行分析；而對(duì)于檢測(cè)，在組織樣本切片制備的過(guò)程中，應(yīng)考慮熒光蛋白的穩(wěn)定性，如GFP遇酸容易淬滅等因素，從而確保檢測(cè)的有效性。

另外，AAV病毒使用前需確認(rèn)是否出現(xiàn)因儲(chǔ)存不當(dāng)而導(dǎo)致滴度下降的情況。

Q7：AAV感染后過(guò)表達(dá)效果弱？
1. 病毒量不夠：應(yīng)充分調(diào)研高分文獻(xiàn)報(bào)道，確定AAV滴度及用量，對(duì)于找不到參考文獻(xiàn)的，也歡迎咨詢(xún)我們。
2. 載體表達(dá)效率低：更換啟動(dòng)子或增加強(qiáng)調(diào)控元件。
3. 細(xì)胞負(fù)反饋機(jī)制：少數(shù)基因受上下游嚴(yán)格調(diào)控，這種情況較難實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)。
4. 基因序列本身的元件：例如GC含量、隱蔽性剪接位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)等，也可影響表達(dá)。因此，密碼子優(yōu)化廣泛用于增強(qiáng)AAV中目的基因表達(dá)。

Q8：AAV的表達(dá)效果能維持多久？
AAV在細(xì)胞內(nèi)主要是以環(huán)狀的dsDNA附加體（circularised dsDNA episomes）的形式存在，而不會(huì)像慢病毒LV那樣整合到宿主細(xì)胞的基因組。對(duì)于分裂不旺盛的細(xì)胞，如神經(jīng)元，AAV可持續(xù)表達(dá)1年以上甚至2年，對(duì)于分裂較旺盛的細(xì)胞，一般也可維持3~6個(gè)月或以上。

Q9：AAV的操作、使用安全性怎么樣？
迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性，實(shí)際上大部分人群都感染過(guò)AAV。野生型AAV在無(wú)輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個(gè)質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成，且Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。