慢病毒（Lentivirus，LV）是由人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）改造而來(lái)的一種病毒載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒。慢病毒可將特定基因片段隨機(jī)、穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)目的產(chǎn)物，因此，目前慢病毒載體已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因的表達(dá)調(diào)控如過(guò)表達(dá)，干擾和基因敲除。

然而，在做病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，科研工作者常遇到一些問(wèn)題，比如為何我的LV包裝出毒量很低？包裝出來(lái)的LV感染細(xì)胞效率低？感染細(xì)胞后生長(zhǎng)狀態(tài)差等，下面就由賽業(yè)生物細(xì)胞生物學(xué)產(chǎn)品經(jīng)理為大家解答這些常見(jiàn)的問(wèn)題。

為何我的LV包裝出毒量很低？
為什么都是采用同樣的慢病毒包裝系統(tǒng)，別人次次成功，我的不是滴度低就是穩(wěn)定性差？這是因?yàn)槌�了包裝系統(tǒng)本身，LV的包裝還與下列幾個(gè)因素密切相關(guān)：
1) 細(xì)胞狀態(tài)：LV的包裝一般使用293T細(xì)胞，293T細(xì)胞的活力、生長(zhǎng)狀態(tài)，是否處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、鋪板是否均勻等對(duì)病毒的產(chǎn)量影響很大，并控制轉(zhuǎn)染前密度為50~60%。

2) 目的基因：目的基因的大小、序列及翻譯的蛋白是否含有毒性均會(huì)影響包裝效果；例如，若目的片段較大（＞2.5k），則可能會(huì)導(dǎo)致包裝滴度下降，甚至無(wú)法包裝。某些過(guò)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的蛋白，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常從而出毒量低（可考慮更換為腺病毒）。

3) 質(zhì)粒質(zhì)量：做好陰性對(duì)照（GFP組），確保包裝目的基因的載體構(gòu)建的完整性，并做好純化。

4) 收毒時(shí)機(jī)：轉(zhuǎn)染后24、48h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及熒光狀態(tài)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好一般于48h第一次收集病毒上清，換液后于72h再次收集病毒上清。

包裝出來(lái)的LV感染細(xì)胞效率低？
理論上LV感染細(xì)胞的能力很強(qiáng)，而且能感染分裂和非分裂期的細(xì)胞，但為什么我的感染效果總是不理想？影響LV感染效果的因素有哪些？
1) 細(xì)胞類(lèi)型：有些細(xì)胞本身就較難被感染，如某些原代細(xì)胞，可考慮加大病毒量或采用濃縮病毒進(jìn)行感染。

2) 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)：感染細(xì)胞前，需要保證細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，以及合適的生長(zhǎng)密度，細(xì)胞膜的流動(dòng)性、與細(xì)胞表面的接觸面積及表面受體的表達(dá)豐富等均會(huì)影響病毒感染細(xì)胞的效果；另外對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以采用離心感染的方法。

3) 病毒質(zhì)量：包裝出來(lái)的LV應(yīng)盡量避免凍融，反復(fù)凍融會(huì)降低病毒的滴度（每次約降低10%），若一次用不完建議分裝后儲(chǔ)存于-80℃，但即使-80℃也不建議超過(guò)6個(gè)月；對(duì)于4℃保存的LV則盡量3天內(nèi)用完。

另外，也可考慮加入Polybrene助感染試劑增強(qiáng)感染效果，但Polybrene本身具有細(xì)胞毒性，謹(jǐn)慎使用。

細(xì)胞感染后生長(zhǎng)狀態(tài)差？
我們用LV感染細(xì)胞是為了進(jìn)行后續(xù)一系列的功能研究，結(jié)果感染后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)很差完全無(wú)法繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，這是什么原因？有什么辦法呢？
1) 純化病毒：病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白、內(nèi)毒素及宿主細(xì)胞DNA等都有可能造成細(xì)胞毒性，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2) 調(diào)整病毒滴度：MOI值是LV感染實(shí)驗(yàn)非常重要的一個(gè)指標(biāo)，我們應(yīng)在確保細(xì)胞狀態(tài)不受影響的情況盡可能用最少的病毒量。某些對(duì)病毒比較敏感的細(xì)胞，過(guò)高的滴度會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞狀態(tài)，可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定病毒感染的最佳MOI值。

3) 外源基因過(guò)度表達(dá)：如果過(guò)度感染使得外源基因過(guò)度表達(dá)，可能導(dǎo)致目的細(xì)胞代謝失衡從而影響生長(zhǎng)狀態(tài)。

如何確定慢病毒MOI值？
MOI即感染復(fù)數(shù)，一般將細(xì)胞有80%被感染時(shí)所用的病毒顆粒數(shù)和細(xì)胞數(shù)目的比值作為該株細(xì)胞的MOI。MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細(xì)胞個(gè)數(shù)

1) 查文獻(xiàn)：通過(guò)高分文獻(xiàn)報(bào)道確定MOI值。

2) 設(shè)計(jì)梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索：以文獻(xiàn)推薦梯度上下各設(shè)置2個(gè)梯度，每個(gè)梯度至少相差兩倍，例如文獻(xiàn)推薦MOI值為8，則設(shè)置為2-4-8-16-32。

3) 梯度感染后，選取細(xì)胞狀態(tài)較好、熒光較多的，或者藥物篩選后細(xì)胞存活率較高的梯度作為使用的MOI值。

怎么檢測(cè)慢病毒滴度呢？
滴度（Titer）：?jiǎn)挝惑w積中有感染能力的病毒數(shù)目；單位：TU/mL（活性滴度單位）。

通常來(lái)說(shuō)LV滴度檢測(cè)：越準(zhǔn)確，就越花時(shí)間；越省事的，就越不準(zhǔn)確。根據(jù)并不是所有的實(shí)驗(yàn)要求都需要精確檢測(cè)，例如對(duì)于構(gòu)建基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或干擾表達(dá)（shRNA）的細(xì)胞株，由于有后續(xù)的篩選的過(guò)程，就可采取快速檢測(cè)法（死病毒也會(huì)檢測(cè)出來(lái)）。

LV滴度的快速檢測(cè)包括QPCR，ELISA和試紙法。其差異在于，QPCR法：檢測(cè)病毒核酸量；ELISA法：檢測(cè)病毒衣殼蛋白量；試紙法：檢測(cè)病毒p24衣殼蛋白含量。

而對(duì)于做RNAi-screening或CRISPR-screening等研究，則需要精確檢測(cè)LV的滴度，包括熒光報(bào)告基因法和抗生素篩選法。

為什么我用LV做基因的干擾表達(dá)效果不好？
對(duì)于干擾慢病毒，提高病毒量對(duì)干擾效果一般不會(huì)有改善效果。干擾效果差一般來(lái)說(shuō)是由以下幾個(gè)原因?qū)е碌模?br />
1）shRNA的特異性：shRNA設(shè)計(jì)而導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)，重新設(shè)計(jì)shRNA。

2）干擾機(jī)制：促進(jìn)mRNA降解還是抑制翻譯？

3）細(xì)胞反饋機(jī)制：某些基因表達(dá)水平降低會(huì)導(dǎo)致核糖體翻譯效率上升，表達(dá)水平上升。

4）結(jié)果判讀建議以蛋白為準(zhǔn)。

LV過(guò)表達(dá)效果差？
在我們用LV進(jìn)行過(guò)表達(dá)時(shí)，常出現(xiàn)以下2種情況：

1) 目的細(xì)胞無(wú)熒光信號(hào)但平行293細(xì)胞有信號(hào)。出現(xiàn)這種情況最可能的原因?yàn)槟康募?xì)胞不易感，屬于難感染細(xì)胞，建議適當(dāng)加大病毒量再?lài)L試。

2) 目的細(xì)胞有熒光但目的基因表達(dá)無(wú)增強(qiáng)。說(shuō)明轉(zhuǎn)染沒(méi)問(wèn)題，且熒光啟動(dòng)子正常工作，若目的蛋白與熒光蛋白是否為同一啟動(dòng)子，包裝前可做啟動(dòng)子活性篩選；另外，考慮目的蛋白是否對(duì)細(xì)胞有毒性，使得目的蛋白被細(xì)胞降解。

另外，對(duì)于過(guò)表達(dá)效果差的一般處理辦法，可采�。禾岣卟《镜味�、更換載體、避免基因反饋（細(xì)胞適應(yīng)）、以及采用誘導(dǎo)表達(dá)的方式。

LV如何介導(dǎo)多個(gè)基因同時(shí)表達(dá)？
1) 若目的基因片段不大，可采用雙向/多啟動(dòng)子分別單獨(dú)啟動(dòng)多個(gè)基因。

2) 若目的基因片段較大，可采用單一啟動(dòng)子啟動(dòng)多個(gè)基因表達(dá)（蛋白融合）。

3) 在不同基因間插入IRES。

4) 在不同基因開(kāi)放閱讀框中插入蛋白酶剪切位點(diǎn)。

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