細(xì)胞培養(yǎng)中污染源的分辨與處理方法
還有一些小伙伴表示，沒(méi)有遇到過(guò)細(xì)胞污染的人多半是沒(méi)有養(yǎng)過(guò)多少細(xì)胞，然而遇到污染不能快速辨別及時(shí)處理的也肯定不是“老司機(jī)”。滴滴滴，老司機(jī)上路了，帶你拯救這些磨人的小妖精們。
常見(jiàn)的細(xì)胞污染類型，如細(xì)菌污染，真菌污染，支原體污染，病毒污染，黑膠蟲(chóng)污染，細(xì)胞株交叉污染等。眾所周知，細(xì)胞污染后最好處理方式是丟棄，重新復(fù)蘇細(xì)胞。但是如果遇到個(gè)別細(xì)胞十分珍貴無(wú)法丟棄時(shí)，我們可嘗試盡力“搶救”一下。那么問(wèn)題來(lái)了，如何分辨污染源呢？確定污染類型后又該如何處理呢？
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污染類型 |
常見(jiàn)種類 |
具體表現(xiàn) |
污染主要來(lái)源 |
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細(xì)菌污染 |
枯草桿菌（Bacillus Subtilis）、大腸桿菌（Escherichia Coli）、假單胞菌（Pseudomonas）、白色葡萄球菌（Staphylococcus Albus） |
細(xì)菌污染會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基1~2d出現(xiàn)黃色或白色渾濁、顏色改變以及pH值急劇變化。 |
操作不當(dāng)或器材消毒不嚴(yán)；細(xì)胞培養(yǎng)試劑污染細(xì)菌未被檢測(cè)出來(lái)。 |
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真菌污染 |
煙曲霉，黑曲霉，毛霉菌，孢子霉，白色念珠菌，酵母菌等 |
真菌污染后短期內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液的渾濁，培養(yǎng)基中會(huì)漂浮白色、淺黃色或黑色的小點(diǎn)，4d左右可以在高倍鏡下觀察到絲狀，管狀或者串珠狀的菌絲。 酵母菌污染，顯微鏡下常見(jiàn)成串的珠狀物，形態(tài)呈卵形，大約比細(xì)胞小5~10倍。當(dāng)其進(jìn)行出芽生殖時(shí)，會(huì)聚集成連體結(jié)構(gòu)。 |
實(shí)驗(yàn)人員（實(shí)驗(yàn)服），并且具有季節(jié)性，像長(zhǎng)蘑菇的季節(jié)很容易感染這種菌類。 |
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支原體污染 |
口腔支原體、發(fā)酵支原體和人型支原體（實(shí)驗(yàn)人員來(lái)源）； 精氨酸支原體和無(wú)膽甾原體（血清來(lái)源）豬鼻支原體（豬來(lái)源的胰酶） |
細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%。支原體早期污染，培養(yǎng)液也不渾濁。后期污染會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基變色、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑、細(xì)胞成團(tuán)、鏡下有小顆粒甚至死亡。 |
實(shí)驗(yàn)人員來(lái)源； 血清來(lái)源； 豬來(lái)源的胰酶；
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病毒污染 |
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一旦細(xì)胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀察到細(xì)胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態(tài)變形，嚴(yán)重時(shí)會(huì)在單層細(xì)胞上觀察到局部破損空斑 |
可能來(lái)源于血清，胰酶及其他動(dòng)物源試劑。如BSA，HSA等。 |
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黑膠蟲(chóng)污染 |
Dr.Cell 目前檢測(cè)的黑膠蟲(chóng)樣本，62%為細(xì)菌，38%為支原體。 |
在顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有小黑點(diǎn)狀顆粒（卵圓狀、球狀、桿狀等），并做活躍的布朗運(yùn)動(dòng)或原地顫動(dòng)，即可大致判斷為黑膠蟲(chóng)污染。 |
因?yàn)槟壳翱茖W(xué)界對(duì)于黑膠蟲(chóng)并無(wú)準(zhǔn)確定論，因此主要來(lái)源也無(wú)法進(jìn)行斷論。根據(jù)Dr.Cell檢測(cè)的黑膠蟲(chóng)樣本可以看出，黑膠蟲(chóng)的來(lái)源是多樣性的，試劑，耗材，人為等都有可能。 |
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細(xì)胞株交叉污染 |
目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。據(jù)統(tǒng)計(jì)約30%細(xì)胞系被交叉污染或錯(cuò)誤辨識(shí)。 |
近年NIH、ATCC、Nature和Science等多次發(fā)出呼吁，要求研究者對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，NIH等權(quán)威機(jī)構(gòu)也將細(xì)胞系鑒定作為基金申請(qǐng)的前提條件。 |
細(xì)胞株的交叉污染，常因不經(jīng)意的實(shí)驗(yàn)疏忽（不同細(xì)胞株分盤時(shí)，共享一瓶培養(yǎng)基；槍頭、移液管忘記更換；）實(shí)驗(yàn)操作人員錄入錯(cuò)誤細(xì)胞株名稱；傳代時(shí)的培養(yǎng)皿；冷凍細(xì)胞時(shí)的凍存管）而發(fā)生，繼而造成后續(xù)數(shù)據(jù)搜集錯(cuò)誤。 |
二、細(xì)胞污染處理方式
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產(chǎn)品名稱-中文名稱 |
貨號(hào) |
作用種類 |
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兩性霉素B，250mg/ml |
03-028-1B |
真菌，酵母菌和霉菌 |
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兩性霉素B，2500mg/ml |
03-029-1B |
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制真霉素，10000units/ml |
03-030-1C |
真菌，酵母菌和霉菌 |
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青鏈雙抗（青霉素-鏈霉素） |
03-031-1B |
對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌G+，革蘭氏陰毒性G- |
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青鏈雙抗（青霉素-鏈霉素）10X濃縮 |
03-031-5B |
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青鏈霉素，制真菌素三抗 |
03-032-1B |
真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- |
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青鏈霉素，兩性霉素B三抗 |
03-033-1B |
真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- |
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青鏈霉素，新霉素三抗 |
03-034-1B |
真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- |
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硫酸慶大霉素溶液，50mg/ml |
03-035-1B |
對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌，支原體 |
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卡那霉素溶液，10mg/ml |
03-049-1B |
對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌，支原體 |
判斷為真菌污染
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產(chǎn)品名稱-中文名稱 |
貨號(hào) |
作用種類 |
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兩性霉素B，250mg/ml |
03-028-1B |
真菌，酵母菌和霉菌 |
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兩性霉素B，2500mg/ml |
03-029-1B |
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制真霉素，10000units/ml |
03-030-1C |
真菌，酵母菌和霉菌 |
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青鏈雙抗（青霉素-鏈霉素） |
03-031-1B |
對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌G+，革蘭氏陰毒性G- |
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青鏈雙抗（青霉素-鏈霉素）10X濃縮 |
03-031-5B |
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青鏈霉素，制真菌素三抗 |
03-032-1B |
真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- |
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青鏈霉素，兩性霉素B三抗 |
03-033-1B |
真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- |
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青鏈霉素，新霉素三抗 |
03-034-1B |
真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- |
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硫酸慶大霉素溶液，50mg/ml |
03-035-1B |
對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌，支原體 |
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卡那霉素溶液，10mg/ml |
03-049-1B |
對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌，支原體 |
判斷為支原體污染
檢測(cè)
可先進(jìn)行PCR檢測(cè)以確定是否為支原體污染。
清除
使用支原體清除試劑。處理試劑依推薦的濃度使用，可去除90%以上實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的支原體污染（無(wú)單一試劑能100%去除支原體污染），沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，處理方法非常便捷。
預(yù)防
預(yù)防大于治療，使用生物安全柜前用支原體預(yù)防噴霧噴灑一次臺(tái)面，CO2培養(yǎng)箱每?jī)芍芤淮螄姙⑾尽?/span>
支原體處理方案：
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中文名稱 |
貨號(hào) |
備注 |
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支原體污染檢測(cè)試劑盒 |
20-700-20 |
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支原體污染處理試劑 |
03-036-1B/C |
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03-037-1B/C |
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03-038-1B/C |
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支原體、細(xì)菌、真菌污染預(yù)防噴霧劑 |
IC-110100 |
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支原體預(yù)防試劑 |
01-867-1B |
100ml，有效消毒二氧化碳培養(yǎng)箱中的水盤 |
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01-916-1E |
50ml，有效消毒任何形式的水浴環(huán)境 |
選用輻照血清以避免任何活的微生物進(jìn)入培養(yǎng)體系。
判斷為黑膠蟲(chóng)污染
使用三抗（貨號(hào)：03-033-1B）結(jié)合支原體處理試劑（貨號(hào)：03-036和03-037或03-038）有效清除實(shí)驗(yàn)室黑膠蟲(chóng)污染。
懷疑存在細(xì)胞交叉污染
Dr.Cell可提供：（點(diǎn)擊名稱鏈接可進(jìn)入詳情頁(yè)）
1. 人源細(xì)胞系STR鑒定（STR Authentication）
2. 細(xì)胞物種鑒定（Species Identification）-15種常見(jiàn)種屬的物種鑒定
☆ 溫馨提示，至少每半年一次進(jìn)行細(xì)胞鑒定，理想情況每2-3個(gè)月鑒定一次，且課題開(kāi)展前最好先確認(rèn)使用的細(xì)胞身份。
最后給科研黨的一點(diǎn)小建議
超凈臺(tái)（生物安全柜）里的滅菌槍頭拿出外頭使用，又放回超凈臺(tái)，或是雙手未經(jīng)酒精殺菌消毒，操作期間觸碰到培養(yǎng)瓶口或是在培養(yǎng)皿上揮過(guò)導(dǎo)致灰塵細(xì)菌掉落而后才是培養(yǎng)環(huán)境不佳，培養(yǎng)箱水盆未定時(shí)清潔擦拭，培養(yǎng)基、緩沖液未適當(dāng)封口保存等。
因此，回歸問(wèn)題根本，預(yù)防勝于治療，操作員應(yīng)重視所有防止污染的操作流程，才是最有效且0成本的預(yù)防。
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