實(shí)例講解：外周單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的計(jì)數(shù)方法

瀏覽次數(shù)：17847　發(fā)布日期：2021-6-30　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

關(guān)于外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

從供體中收集全血，分離并保存PBMC，同時(shí)保留剩余的血細(xì)胞和成分返回到主體（單采血液成分法）¹。該過程產(chǎn)生大量的PBMC，其適合于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)或研究。

PBMC的計(jì)數(shù)
PMBC的大小小于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，并且取決于樣本，可能包含紅細(xì)胞（紅細(xì)胞，RBC）污染。建議在通過康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)之前，通過離心分離或裂解去除RBC。
PMBC通常使用費(fèi)時(shí)的手動(dòng)方法（例如血球計(jì)數(shù)器）進(jìn)行計(jì)數(shù)。自18世紀(jì)2以來，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀一直被認(rèn)為是進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)果通常是主觀的，易變的，并且細(xì)胞直徑的細(xì)微差異無法輕易或可重復(fù)地產(chǎn)生被察覺。

康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器提供了另一種方法，可以快速，準(zhǔn)確地對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。開發(fā)了計(jì)數(shù)算法以識(shí)別和清除碎片并解決死細(xì)胞的問題，同時(shí)該應(yīng)用程序的功能允許對(duì)種群進(jìn)行門控，以從最終計(jì)數(shù)中清除較大的細(xì)胞和碎片。

材料和方法
使用康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器和使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)在兩個(gè)不同的天對(duì)來自兩個(gè)供體（所有細(xì)胞；阿拉米達(dá)，加利福尼亞）的冷凍保存的PBMC（無RBC）進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后立即進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和錐蟲藍(lán)排除法確定細(xì)胞活力。計(jì)數(shù)區(qū)域（1.96毫米2）的代表性圖像如（圖1）所示。

使用了康寧單元計(jì)數(shù)器的多計(jì)數(shù)功能（作為一個(gè)計(jì)數(shù)的一部分，最多可以采樣八個(gè)字段）。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)每個(gè)計(jì)數(shù)采樣了八個(gè)不同的區(qū)域（總面積= 15.68 mm2），而手動(dòng)方法對(duì)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的五個(gè)大正方形進(jìn)行了計(jì)數(shù)（總面積= 5 mm2）。

圖1.調(diào)焦后和計(jì)數(shù)后的代表性康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器圖像。

（A）計(jì)數(shù)前正確聚焦圖像。
（B）計(jì)數(shù)結(jié)果。活細(xì)胞（綠色圓圈）；死細(xì)胞（紅色圓圈）。通過算法和用戶指定細(xì)胞大小的門控，可以排除小細(xì)胞和碎片的計(jì)數(shù)（圖2中的示例）。
（C）面板（B）的放大圖。

圖2.

（A）直方圖顯示了澆口直徑設(shè)置為5至16 µm。超出此閾值的單元格從計(jì)數(shù)中排除�？梢郧袚Q死細(xì)胞（紅色條）和活細(xì)胞（綠色條）以獨(dú)立檢查那些亞群。顯示了一個(gè)樣品中八個(gè)計(jì)數(shù)的平均值±SD；如所述使用多計(jì)數(shù)功能。
（B）可通過使用多計(jì)數(shù)功能獲得擴(kuò)展的數(shù)據(jù)。

結(jié)果和討論

使用CytoSMART™應(yīng)用程序或CytoSMART云中結(jié)果頁(yè)面的直方圖功能，門控設(shè)置為5至16 µm（圖2）。對(duì)于此評(píng)估期間生成的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，（圖3）和（圖4）顯示了兩個(gè)供體在10個(gè)獨(dú)立樣本中的結(jié)果。

當(dāng)使用配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩種計(jì)數(shù)方法時(shí)，細(xì)胞密度和活力百分比的p值均大于0.05，表明每個(gè)數(shù)據(jù)集之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果表明康寧®細(xì)胞計(jì)數(shù)器適合由經(jīng)過培訓(xùn)的操作員對(duì)PMBC進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。

對(duì)PBMC進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，重要的是避免計(jì)數(shù)不是細(xì)胞的死細(xì)胞。要在康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)為死細(xì)胞，該細(xì)胞在所有字段中必須顯示為暗色，如（圖5）所示。另外，還要注意計(jì)數(shù)的樣品中不存在RBC，因?yàn)檫@可能會(huì)降低計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

圖3.通過計(jì)數(shù)方法得出的細(xì)胞密度（圖表以供體分隔）。聯(lián)合供體的配對(duì)t檢驗(yàn)p = 0.141。

圖4.通過計(jì)數(shù)方法得出的細(xì)胞活力（圖表以供體分隔）。聯(lián)合供體的配對(duì)t檢驗(yàn)p = 0.718。

圖5.活細(xì)胞與死細(xì)胞聚焦圖像

結(jié)論
康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器可用于需要精確細(xì)胞計(jì)數(shù)的PBMC計(jì)數(shù)中，并用作血細(xì)胞計(jì)數(shù)器手動(dòng)計(jì)數(shù)的替代方法。
盡管康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器非常易于使用，但需要觀察到適當(dāng)?shù)木劢辜夹g(shù)，以避免來自不同用戶的計(jì)數(shù)的主觀性。每一次計(jì)算，用戶都將獲得經(jīng)驗(yàn)和熟練程度，從而提高準(zhǔn)確性。

與通過手動(dòng)方式相比，可以在康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)器上對(duì)密度更高的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，將更準(zhǔn)確地表示整個(gè)細(xì)胞群體，并且完全避免了“咔噠聲疲勞”的相關(guān)問題。
與手動(dòng)計(jì)數(shù)相比，使用多計(jì)數(shù)功能是對(duì)較大區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)的一種快速簡(jiǎn)便的技術(shù)。

康寧細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可在三秒內(nèi)完成單次細(xì)胞計(jì)數(shù)*，相較大多數(shù)的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀更快。傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)是基于圖像分析算法在一個(gè)相對(duì)較小的計(jì)算平臺(tái)上完成。而 Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀則采用CytoSMART™云計(jì)算應(yīng)用軟件，通過MicrosoftAzure云端計(jì)算平臺(tái)進(jìn)行圖像處理。這種云計(jì)算系統(tǒng)意味著更快更準(zhǔn)確的圖像分析能力。

準(zhǔn)確率高
Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀使用先進(jìn)的圖像分析處理軟件，應(yīng)用復(fù)雜的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，使細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性達(dá)到最大。若添加臺(tái)盼藍(lán)，儀器便可在計(jì)數(shù)時(shí)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，從而計(jì)算出細(xì)胞活力。同時(shí)該軟件還能對(duì)含有細(xì)胞簇的樣本進(jìn)行分析處理，所以對(duì)高濃度的細(xì)胞樣本（高達(dá)1 x 10 7 個(gè)細(xì)胞/ mL）Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀亦能進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。

計(jì)數(shù)成本低
每臺(tái)Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀會(huì)提供一片可重復(fù)使用的細(xì)胞計(jì)數(shù)板，很大程度的節(jié)約了客戶一次性耗材的投入成本。同時(shí)客戶也可使用相應(yīng)的血球計(jì)數(shù)板結(jié)合Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

操作簡(jiǎn)便
Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀操作十分簡(jiǎn)便，無需花費(fèi)過多的時(shí)間進(jìn)行人員操作培訓(xùn)。首先，將儀器連接到您的計(jì)算機(jī)或平板電腦，啟動(dòng)CytoSMART™云應(yīng)用程序。然后，將裝有樣本的細(xì)胞計(jì)數(shù)板放置在儀器上，調(diào)整焦距，點(diǎn)擊“計(jì)數(shù)”按鈕，即可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，可對(duì)8次計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行同步分析。

隨時(shí)隨地查看數(shù)據(jù)
傳統(tǒng)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀瓶頸：
◗ 機(jī)載的計(jì)算機(jī)系能較小，報(bào)告生成時(shí)間過長(zhǎng)。
◗ 屏幕分辨率低，不能很好的分辨出活細(xì)胞或死細(xì)胞。
◗ 只能通過U盤將數(shù)據(jù)導(dǎo)出。

Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀很好的解決了以上難題。Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可在計(jì)算機(jī)上快速生成測(cè)試報(bào)告，包含計(jì)數(shù)樣本的細(xì)胞濃度和活力，以及標(biāo)注活細(xì)胞和死細(xì)胞的樣本圖像（若計(jì)數(shù)時(shí)添加臺(tái)盼藍(lán)），并將報(bào)告發(fā)送至CytoSMART™云端，使您可以隨時(shí)隨地在智能手機(jī)，平板電腦或計(jì)算機(jī)上查閱生成的圖像和計(jì)數(shù)結(jié)果。所有測(cè)試生成的報(bào)告都將保存在CytoSMART™云端，因此您可以調(diào)閱相聯(lián)實(shí)驗(yàn)的報(bào)告分析細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)和質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)
1.https://www.allcells.com/tissue-products/leukopak/
2. Lin-Gibson S, et al. Summary of the National Institute of Standards and Technology and US Food and Drug Administration cell counting workshop: Sharing practices in cell counting measurements Cytotherapy, 2018; 20:785-795.

索取資料

來源：廣州科適特科學(xué)儀器有限公司
聯(lián)系電話：020-38102730
E-mail：sales@kosterscience.com

【點(diǎn)擊可查看廣州科適特科學(xué)儀器有限公司相關(guān)產(chǎn)品】

分享到：QQ空間新浪微博騰訊微博微信

【所有文章】【本類新聞】【相關(guān)產(chǎn)品】【關(guān)閉窗口】

網(wǎng)友評(píng)論 已有[1]人評(píng)論

匿名 (123.14.97.112)
conning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是在顯微鏡下顯示細(xì)胞，計(jì)數(shù)的是視野內(nèi)的細(xì)胞。顯微鏡下視野大小隨放大倍數(shù)和聚焦距離變化。計(jì)數(shù)區(qū)域面積1.96毫米2是怎么確定的？真實(shí)性，準(zhǔn)確度多大，有參照標(biāo)準(zhǔn)嗎？請(qǐng)通過郵箱回復(fù)。
2022-2-25 10:31:00

本類文章

本類新聞

综合图区亚洲网友自拍|亚洲黄色网络|成人无码网WWW在线观看,日本高清视频色视频kk266,激情综合五月天,欧美一区日韩一区中文字幕页

實(shí)例講解：外周單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的計(jì)數(shù)方法