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標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞冷凍、解凍方法指南-–實現(xiàn)重現(xiàn)性更高的細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)果
摘要
在細(xì)胞研究和生產(chǎn)的各個領(lǐng)域，將冷凍的細(xì)胞解凍是一項必不可少的操作，但在一些情況下這一操作要素被低估了。超低溫保存過程的標(biāo)準(zhǔn)化 — 包括標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞解凍方案 — 有助于最大限度地保證細(xì)胞凍存效果，從而獲得既可重現(xiàn)又可靠的結(jié)果。
內(nèi)容概覽
> 簡介
> 如何解凍細(xì)胞
> 細(xì)胞解凍方法
> 選擇解凍方法前的注意事項
> 總結(jié)
簡介
在細(xì)胞生物學(xué)中，細(xì)胞的冷凍和解凍一直是其中一項標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。這一過程也被稱為超低溫保存，能夠有效地停止細(xì)胞衰亡，因為這一過程允許幾乎近似的細(xì)胞批次在數(shù)月、數(shù)年甚至數(shù)十年之后使用（圖 1），可大幅提高在不同時間進(jìn)行的實驗的重現(xiàn)性，還有助于節(jié)省時間、資源和成本 [1]。
圖 1： 二級細(xì)胞庫系統(tǒng)概要示意圖：建立主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫，包括最低傳代所需細(xì)胞的超低溫保存，是一種良好的細(xì)胞培養(yǎng)方法
在整個冷凍 - 儲存 - 解凍過程中，面臨的一項關(guān)鍵性挑戰(zhàn)是確保高細(xì)胞存活率，或許更重要的是確保超低溫保存細(xì)胞行為的可預(yù)測性和重現(xiàn)性。為此，人們制定了許多不同的指導(dǎo)方針和方案。
在超低溫保存過程中，造成細(xì)胞死亡的主要原因是胞內(nèi)冰晶的形成。以錯誤的方式冷凍時，會在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，這可能會損壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而大幅降低細(xì)胞恢復(fù)的可能性。
為了幫助防止形成胞內(nèi)冰晶，每個細(xì)胞冷凍方案都有兩項基本要求。第一項基本要求是在冷凍劑中加入低溫保護(hù)劑，二甲亞砜(DMSO) 或甘油等化合物會穿透細(xì)胞膜，這通常會降低培養(yǎng)基的凝固點和玻璃轉(zhuǎn)換溫度，從而防止在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 [2,3]。
在超低溫保存過程中，造成細(xì)胞死亡的主要原因是胞內(nèi)冰晶的形成。以錯誤的方式冷凍時，會在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，這可能會損壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而大幅降低細(xì)胞恢復(fù)的可能性。
為了幫助防止形成胞內(nèi)冰晶，每個細(xì)胞冷凍方案都有兩項基本要求。第一項基本要求是在冷凍劑中加入低溫保護(hù)劑，二甲亞砜(DMSO) 或甘油等化合物會穿透細(xì)胞膜，這通常會降低培養(yǎng)基的凝固點和玻璃轉(zhuǎn)換溫度，從而防止在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 [2,3]。
第二項要求是緩慢冷卻。在 4 到 –70 °C 之間的臨界溫度范圍內(nèi)，以每分鐘 1 °C 的速率冷卻細(xì)胞懸液通常被視為最適宜于細(xì)胞存活，無論是哪種細(xì)胞類型 [3]。這是因為，以較慢的速度冷卻細(xì)胞可確保首先在細(xì)胞外部形成低溶質(zhì)冰晶，從而增加剩余培養(yǎng)基中的溶質(zhì)濃度，并在滲透作用下排出細(xì)胞。這反過來可減少細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶 [3]。
在受控冷凍至至少 –70 °C 的溫度后，可將凍存管移入液氮儲存區(qū)（–150 至 –196 °C，圖 2）或在 –150 °C 下運行的深低溫冰箱內(nèi)長期保存 [4]。
圖 2： 建議使用液氮儲存區(qū)長期儲存細(xì)胞。
有很多教科書和在線資源中都詳細(xì)介紹了幫助科學(xué)家實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的可靠細(xì)胞冷凍的原理和步驟，但是對細(xì)胞解凍過程相關(guān)的注意事項幾乎沒有講解。下文概述了細(xì)胞解凍的原理，描述了不同的方法，并討論了改進(jìn)細(xì)胞解凍方案標(biāo)準(zhǔn)化的注意事項。
如何解凍細(xì)胞
冷凍細(xì)胞需要以緩慢而可控的速率進(jìn)行，但是將冷凍的細(xì)胞解凍時最好采用較快的速度。細(xì)胞周圍冰晶的消失不會產(chǎn)生與冰晶形成相同的破壞效應(yīng)，因此最好盡快使細(xì)胞恢復(fù)到正常培養(yǎng)條件，以便（對于粘附細(xì)胞）能夠錨固在表面上。
典型的細(xì)胞解凍方案通常是從液氮儲存區(qū)中取出凍存管開始。在這一步驟中，必須熟悉操作液氮的所有常見預(yù)防措施（圖 3）[5]。此外，如果凍存管未能正確密封并且儲存在液相中，則隨著時間的推移，液氮可能會滲入管中，導(dǎo)致在從液氮中取出后不久，管內(nèi)的壓力迅速增大 — 因此，務(wù)必佩戴適當(dāng)?shù)拿娌糠雷o(hù)裝置。
圖 3： 從液氮儲存區(qū)收集細(xì)胞時應(yīng)注意防護(hù)。
圖片來源： Minerva Studio/shutterstock.com
圖片來源： Minerva Studio/shutterstock.com
接下來，必須將凍存管解凍。一個常用的經(jīng)驗法則是，在一個含有 1 mL 細(xì)胞懸液的標(biāo)準(zhǔn)凍存管中開始解凍細(xì)胞時，所有冰晶都會在幾分鐘內(nèi)消失，快速加熱可防止在解凍過程中出現(xiàn)局部再結(jié)晶，否則可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷 [6]。
有時，由于尋找不同的凍存管所花費的時間或由于液氮儲存區(qū)的位置等因素，無法在幾分鐘內(nèi)完成解凍。在這種情況下，將緩慢解凍和將細(xì)胞留在解凍的冷凍劑中超過所需的時間相比，那么凍存管置于盡可能低的溫度下然后快速解凍的做法更加可取 [7]。
當(dāng)所有的冰晶都消失后，需要盡量減小低溫保護(hù)劑對細(xì)胞的任何進(jìn)一步的不利影響。有兩種方法可實現(xiàn)這一點。首先，可以直接培養(yǎng)細(xì)胞，例如在方瓶中培養(yǎng)，同時確保用正常培養(yǎng)基將冷凍劑稀釋至少 10 倍�；蛘撸部梢杂闷胀ㄅ囵B(yǎng)基稀釋冷凍劑，把試管離心，移除培養(yǎng)基，然后在新鮮培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)細(xì)胞 [1,4,7]。
為了檢查細(xì)胞解凍方案是否成功，建議測定存活細(xì)胞的百分比（例如，使用臺盼藍(lán)染色法和細(xì)胞計數(shù)器） [8]。為了改善標(biāo)準(zhǔn)，最好持續(xù)幾天觀察培養(yǎng)液中的細(xì)胞形態(tài)或生長速率有無任何異常。生長不良或不一致可能表示細(xì)胞制備或超低溫保存過程中出現(xiàn)問題，因此早期檢測可能有助于減少實驗誤差。
有時，由于尋找不同的凍存管所花費的時間或由于液氮儲存區(qū)的位置等因素，無法在幾分鐘內(nèi)完成解凍。在這種情況下，將緩慢解凍和將細(xì)胞留在解凍的冷凍劑中超過所需的時間相比，那么凍存管置于盡可能低的溫度下然后快速解凍的做法更加可取 [7]。
當(dāng)所有的冰晶都消失后，需要盡量減小低溫保護(hù)劑對細(xì)胞的任何進(jìn)一步的不利影響。有兩種方法可實現(xiàn)這一點。首先，可以直接培養(yǎng)細(xì)胞，例如在方瓶中培養(yǎng)，同時確保用正常培養(yǎng)基將冷凍劑稀釋至少 10 倍�；蛘撸部梢杂闷胀ㄅ囵B(yǎng)基稀釋冷凍劑，把試管離心，移除培養(yǎng)基，然后在新鮮培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)細(xì)胞 [1,4,7]。
為了檢查細(xì)胞解凍方案是否成功，建議測定存活細(xì)胞的百分比（例如，使用臺盼藍(lán)染色法和細(xì)胞計數(shù)器） [8]。為了改善標(biāo)準(zhǔn)，最好持續(xù)幾天觀察培養(yǎng)液中的細(xì)胞形態(tài)或生長速率有無任何異常。生長不良或不一致可能表示細(xì)胞制備或超低溫保存過程中出現(xiàn)問題，因此早期檢測可能有助于減少實驗誤差。
圖 4： 觀察解凍后培養(yǎng)液中細(xì)胞的形態(tài)是否異常。
正常(a)和異常(b)的細(xì)胞形態(tài)示例（Vero細(xì)胞， 10 x）
正常(a)和異常(b)的細(xì)胞形態(tài)示例（Vero細(xì)胞， 10 x）
下載“細(xì)胞配置文件”模板，清晰、一致地記錄培養(yǎng)的重要細(xì)節(jié)
細(xì)胞解凍方法
表 1.不同細(xì)胞解凍方法的優(yōu)缺點概覽
在實驗室最常用的解凍冷凍細(xì)胞的方法可能是使用公用水浴槽（圖 4）。水具有良好的導(dǎo)熱性，可以保證快速加熱，同時也可以防止凍存管內(nèi)部局部過熱。水浴槽也是細(xì)胞培養(yǎng)實驗室日常使用的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備的之一，因此無需額外的準(zhǔn)備或投資。
使用水浴槽或任何其他解凍方法加熱細(xì)胞時，切勿將細(xì)胞暴露在高于 37 °C 的溫度下。盡管加熱過程中的溫度總變化可能超過 200 °C，但如果管內(nèi)的局部溫度超過 37 °C，這會迅速誘發(fā)不良影響，甚至是細(xì)胞死亡 [9]。
然而，水浴槽的一個主要缺點是水和樣品接觸可能造成污染。由于水位、持續(xù)檢查凍存管的需要以及攪拌樣品以防止產(chǎn)生溫度梯度的要求，在解凍過程中很難保持凍存管頂部的干燥 [6]。
手動加熱
通過手動加熱凍存管將細(xì)胞解凍是一種廣受歡迎的方法，因為它不需要任何設(shè)備，主體溫度與水浴槽相似，而且使用戶能夠連續(xù)監(jiān)測并輕柔搖動凍存管。但必須注意，與將凍存管浸沒在水中相比，傳熱效率要低得多，變數(shù)也很多，這使得手動加熱凍存管的速度可能較慢，重現(xiàn)性也較低。
同時解凍兩個以上的凍存管時，手動加熱也不實用，還會導(dǎo)致冷卻速率減慢。此外，將皮膚暴露在接近–196 °C 的溫度下，即使佩戴了丁腈手套也會造成嚴(yán)重傷害。出于這些原因，不建議進(jìn)行手動加熱。
同時解凍兩個以上的凍存管時，手動加熱也不實用，還會導(dǎo)致冷卻速率減慢。此外，將皮膚暴露在接近–196 °C 的溫度下，即使佩戴了丁腈手套也會造成嚴(yán)重傷害。出于這些原因，不建議進(jìn)行手動加熱。
金屬珠浴恒溫箱
當(dāng)加熱細(xì)胞培養(yǎng)基或在培養(yǎng)箱外保持培養(yǎng)液的溫度時，可以使用金屬珠浴恒溫箱代替水浴槽。但是，與手動加熱或空氣加熱（例如在培養(yǎng)箱中）類似，珠子并不具備水浴槽的高效傳熱能力，因為與容器接觸的表面積較小，導(dǎo)致無法可靠地或足夠快速地解凍細(xì)胞。通常情況下推廣使用珠浴恒溫箱，因為珠浴恒溫箱不需要換水，但隨著時間的推移，灰塵和溢出物的積聚就需要清潔和重新安裝，以防止污染。
選擇解凍方法前的注意事項
實驗室特有的注意事項
比較不同的細(xì)胞解凍方法時，不可避免地要考慮到許多實驗室特有的注意事項。其中一個要注意的事項是在潔凈室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時。在這種環(huán)境下，水浴槽可能成為空氣污染的來源，因此應(yīng)考慮采用替代方法 [10]。
影響解凍方法選擇的另一個具體情況是，在細(xì)胞培養(yǎng)實驗室中工作時，需要記錄和跟蹤每一個工作步驟，或者需要保持恒定的加熱速率 [6,11]。當(dāng)然，在選擇使用現(xiàn)有設(shè)備或使用專用裝置進(jìn)行細(xì)胞解凍時，可用的實驗室設(shè)備預(yù)算具有關(guān)鍵性的影響。
影響解凍方法選擇的另一個具體情況是，在細(xì)胞培養(yǎng)實驗室中工作時，需要記錄和跟蹤每一個工作步驟，或者需要保持恒定的加熱速率 [6,11]。當(dāng)然，在選擇使用現(xiàn)有設(shè)備或使用專用裝置進(jìn)行細(xì)胞解凍時，可用的實驗室設(shè)備預(yù)算具有關(guān)鍵性的影響。
專用裝置
在過去的十年中，一些制造商開發(fā)了可以不使用水浴槽而實現(xiàn)所需的快速加熱解凍的專用裝置。大多數(shù)裝置都是專為凍存管設(shè)計的，當(dāng)然也有可以處理更大體積的系統(tǒng)。專用裝置可以設(shè)置程序執(zhí)行解凍過程。在對解凍過程的標(biāo)準(zhǔn)化和文檔化有更高要求的情況下，這將帶來許多好處。這些裝置也非常適合于不能實行水浴加熱的情況 [6]。專用解凍裝置最重要的缺點是需要前期投資。水浴槽解凍通常不需要額外的投資，而專用的解凍設(shè)備增加了細(xì)胞培養(yǎng)工作流的額外成本。另外，有些裝置一次只能解凍一個凍存管，導(dǎo)致可能與某些細(xì)胞培養(yǎng)方案不相容。
細(xì)胞解凍的標(biāo)準(zhǔn)化
不管選擇哪一種方法，標(biāo)準(zhǔn)化都會大幅改善結(jié)果 — 無論是在監(jiān)管環(huán)境下工作還是基礎(chǔ)研究。例如，保持一致的細(xì)胞存活率可以減少解凍過量細(xì)胞的需要，從而可確保擁有足夠的細(xì)胞儲備，當(dāng)細(xì)胞量較少時這就尤為重要。
方案標(biāo)準(zhǔn)化也會影響細(xì)胞在平板培養(yǎng)后的行為。例如，當(dāng)長時間暴露于 DMSO 時，一些類型的細(xì)胞更有可能發(fā)生分化 [12]。因此，冷凍或解凍方案的變化可能會導(dǎo)致超低溫保存后細(xì)胞表型的差異和結(jié)果的變化。
方案標(biāo)準(zhǔn)化也會影響細(xì)胞在平板培養(yǎng)后的行為。例如，當(dāng)長時間暴露于 DMSO 時，一些類型的細(xì)胞更有可能發(fā)生分化 [12]。因此，冷凍或解凍方案的變化可能會導(dǎo)致超低溫保存后細(xì)胞表型的差異和結(jié)果的變化。
細(xì)胞類型特定的注意事項
有許多冷凍和解凍方面適用于所有細(xì)胞類型，但必須注意，一些方面可能因某些細(xì)胞類型而異，因此應(yīng)盡可能使用適合特定細(xì)胞類型的解凍方案。許多商業(yè)細(xì)胞系已經(jīng)過全面的研究并且優(yōu)化了超低溫保存方案，但對于不常見的細(xì)胞類型，建議進(jìn)行文獻(xiàn)檢索或進(jìn)行小規(guī)模的優(yōu)化研究。
每種細(xì)胞類型的細(xì)胞解凍都各不相同，需要密切關(guān)注細(xì)胞恢復(fù)正常生長和正常響應(yīng)刺激物所需的時間。例如，如果增殖速率是研究的一個關(guān)鍵參數(shù)，很重要的一點是，不要從尚未完全從解凍過程中恢復(fù)的細(xì)胞開始實驗 — 因為不同類型的細(xì)胞之間可能存在較大差異。比如，當(dāng)測量特定蛋白的表達(dá)時，細(xì)胞需要完全恢復(fù)產(chǎn)生這種蛋白的能力 [7]。
總結(jié)每種細(xì)胞類型的細(xì)胞解凍都各不相同，需要密切關(guān)注細(xì)胞恢復(fù)正常生長和正常響應(yīng)刺激物所需的時間。例如，如果增殖速率是研究的一個關(guān)鍵參數(shù)，很重要的一點是，不要從尚未完全從解凍過程中恢復(fù)的細(xì)胞開始實驗 — 因為不同類型的細(xì)胞之間可能存在較大差異。比如，當(dāng)測量特定蛋白的表達(dá)時，細(xì)胞需要完全恢復(fù)產(chǎn)生這種蛋白的能力 [7]。
為了在細(xì)胞培養(yǎng)實驗室獲得一致的結(jié)果，務(wù)必在細(xì)胞培養(yǎng)的每一步實現(xiàn)高水平的標(biāo)準(zhǔn)化。細(xì)胞解凍有多種不同的方法可供使用 — 在設(shè)定可靠數(shù)據(jù)和可靠產(chǎn)品的正確標(biāo)準(zhǔn)時，選擇適合每種特定的細(xì)胞類型、實驗室或應(yīng)用的細(xì)胞解凍方案是關(guān)鍵。
參考文獻(xiàn)
[1]https://www.lgcstandards-atcc.org/Documents/Marketing_Literature /Animal_Cell_Culture_Guide/Cryopreservation.aspx
[3] Oishi, K et al. Cryopreservation of Mouse Adipose Tissue-Derived Stem/Progenitor Cells.
Cell Transplantation 2008; 17: 35–41.
[4] https://www.lgcstandards-atcc.org/How_to_Revive_Cultures.aspx
[5] https://www.labmanager.com/lab-health-and-safety/keeping-cool-under-pressure-5552
[6] Hunt, CJ. Technical Considerations in the Freezing, Low-Temperature Storage and Thawing of Stem Cells for Cellular Therapies. Transfusion Medicine and Hemotherapy 2019; 46: 134–149.
[7] Baust, JM et al. Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells.
In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal 2017.
[8] Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology 2019.
[9]https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/358505-Cryopreservation-Freezing-Solutions
[10] https://www.news-medical.net/life-sciences/What-are-Cleanrooms.aspx
[11]https://www.bioprocessonline.com/doc/cell-thawing-are-you-risking-gmp-compliance-with-the-water-bath-method-0001
[12] Best, BP. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research 2015; 18(5): 422–436.
標(biāo)簽：
細(xì)胞解凍
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