小鼠疾病模型在藥物臨床前評價研究中面臨的挑戰(zhàn)？

小鼠疾病模型在轉化醫(yī)學研究中已發(fā)揮了極其重要的作用，無論是致病基因功能還是新藥研發(fā)的臨床前評價研究等方面。然而，關于小鼠疾病模型應用于藥物臨床前評價研究預測有效性的問題，也一直是科學家及生物醫(yī)藥企業(yè)十分關注與思考的問題。已有的經驗教訓表明，如何構建小鼠疾病模型，以及如何從已有的模型中選擇合理的小鼠疾病模型等，都會直接影響到藥物臨床前評價研究結果的轉化效率。比如，由于肌萎縮側索硬化（ALS）小鼠疾病模型的錯誤選擇，導致大多數(shù)臨床前驗證實驗通過的藥物，到了臨床試驗階段，卻以失敗告終。

ALS也叫運動神經元病(MND), 影響中樞神經系統(tǒng)上下運動神經。ALS患者出現(xiàn)擴張性肌肉消耗和萎縮，導致癱瘓，疾病出現(xiàn)后3-5年死亡。ALS分為家族性(fALS,10%) 和散發(fā)性(sALS, 90%)。目前已經報道約50多個基因突變與ALS相關，但病理性突變相關致病基因多集中在SOD1, C9ORF72, FUS和TDP-43。

ALS小鼠疾病模型的構建為深入探索與揭示ALS病理學機制，以及開展藥物臨床前評價研究等，發(fā)揮了重要作用。比如，最早的SOD1基因突變轉基因小鼠疾病模型，為ALS的早期研究鋪平了道路。1993年，SOD1作為第一個ALS致病相關基因被發(fā)現(xiàn)，該基因突變占家族性ALS∼20% 、散發(fā)性ALS∼2%, 且該基因編碼區(qū)域突變數(shù)超過150個，可以引起顯性毒性作用。目前已成功構建了超過20多種嚙齒類動物模型，多為人SOD1基因突變體的隨機過表達小鼠模型，而SOD1基因敲除小鼠模型卻未見任何表型。

人SOD1G93A點突變轉基因小鼠，是最早、且應用最多的ALS小鼠疾病模型，用于約97%的ALS藥物臨床前評價實驗研究。其次為SOD1G37R突變小鼠。應用人SOD1基因啟動子及調控序列，表達人SOD1基因G93A突變體，構建不同人源化SOD1突變體轉基因小鼠模型。研究表明，有SOD1G93A突變小鼠含有25個拷貝的人SOD1G93A突變體，比內源性小鼠SOD1基因的表達量高約13倍。初步的研究發(fā)現(xiàn)，不同的人SOD1基因突變轉基因小鼠，雖然在疾病癥狀出現(xiàn)時間與嚴重程度等方面表現(xiàn)不同，但都會出現(xiàn)不同程度與人ALS疾病相似的進行性運動神經元疾病表型。

然而，進一步深入研究這些所謂小鼠ALS疾病模型發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)人SOD1G93A突變轉基因小鼠，并未出現(xiàn)人ALS疾病患者中非常重要的病理特征，即出現(xiàn)大量腦皮層運動神經元退行性變化。因此，有人認為，作為人運動神經元疾病特征的研究工具，SOD1G93A突變小鼠疾病模型本有其先天不足。

另外，更為有趣的發(fā)現(xiàn)是，如果在小鼠體內過表達人野生型SOD1基因，也能誘發(fā)小鼠一定程度的神經元損傷表型，說明SOD1蛋白過度表達聚集，具有毒性作用。有人提出，與過度蛋白聚集的毒性假設一致，疾病發(fā)生嚴重程度與外源基因拷貝數(shù)增加（不管是突變體還是野生體）密切相關。因此，有理由懷疑，應用SOD1突變小鼠疾病模型，雖然可能對ALS致病機制研究有所幫助，但如果開展藥物臨床前評價研究，可能難以發(fā)揮其臨床有效轉化的作用。過去在針對ALS疾病的藥物臨床試驗中，除了一個藥物（riluzole）表現(xiàn)有中等程度延緩疾病發(fā)生作用外，其他潛在藥物均在臨床試驗中遭遇失敗，也許就是個很好的證明。

關于家族型與散發(fā)型ALS表型及病理機制的問題。SOD1突變較少存在于散發(fā)型ALS患者中，但散發(fā)型ALS表型與家族型ALS相似，有研究者認為，這兩種類型ALS可能具有共同的神經退行性通路。所以，研究家族型ALS有助于深入了解散發(fā)型ALS病理機制。但也有研究者持不同觀點，認為SOD1突變小鼠模型可能只反映家族型ALS患者表型，而不是那些散發(fā)型ALS患者，或者98%的非家族型ALS患者基因突變現(xiàn)象。

ALS研究的新發(fā)現(xiàn)，即突變TDP-43蛋白引起異常RNA加工過程。TDP-43蛋白為TARDBP基因編碼，是DNA/RNA結合蛋白。已發(fā)現(xiàn)超過48個TARBDP基因變異體與ALS疾病相關。研究表明，雖然TDP-43突變只占家族性ALS患者3%，但運動神經元內的高磷酸化突變截短蛋白聚集和/或泛素化TDP-43，卻參與了超過95%ALS患者腦部與脊髓神經衰退性變化。由于TDP-43蛋白具有RNA加工、傳遞和剪切等功能，目前認為，TDP-43突變與大多數(shù)ALS疾病的發(fā)生相關。關于TDP-43致病理論依據(jù)是，該突變蛋白與一些相關RNA結合后，通過蛋白增加毒性功能機制，改變這些RNA在細胞質內的代謝過程。該基因如果在細胞核內被去除，則是通過蛋白缺失功能機制，引起相似的RNA代謝改變。所以，TDP-43平衡狀態(tài)是維持正常細胞功能的關鍵因素。該蛋白過表達和缺失均可成為ALS疾病的致病原因。

TDP-43純合全身敲除小鼠出現(xiàn)胚胎致死表型 ，雜合子敲除小鼠可存活，但老年小鼠出現(xiàn)運動障礙跡象。為了探索TDP-43蛋白在中樞神經系統(tǒng)及ALS作用機制，有研究者利用朊病毒啟動子（PrP) 表達A315T突變體或野生體TDP-43蛋白，構建神經系統(tǒng)表達的轉基因小鼠。該研究表明，Prp-TDP43A315T轉基因小鼠出現(xiàn)進行性致命神經退行性疾病。雖然突變基因在整個神經系統(tǒng)表達，但泛素化蛋白沉積的病理學變化集中在特殊神經元細胞，包括額葉皮層錐體與脊髓運動神經元，但卻未見細胞漿TDP-43聚集。提示DNA/RNA結合蛋白功能改變，而不是毒物聚集，導致了神經退行性變化。

然而，后來的進一步研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43A315T小鼠模型并未表現(xiàn)令人信服的ALS樣肌肉神經功能缺陷表型，而突變小鼠早期死亡與胃腸(GI)功能損傷有關。表現(xiàn)為進行性胃腸蠕動性降低，最終導致GI運動停止。所以，目前認為，TDP-43A315T突變小鼠疾病模型可能適合研究胃腸道神經退行性表型，但并不適合ALS疾病的藥物臨床前評價驗證研究。

如何構建與選擇理想合理的小鼠疾病模型？

ALS小鼠疾病模型用于藥物臨床前評價研究轉化效率低的經驗教訓，也讓我們思考一個非常重要的問題，即如何構建與選擇合理且理想的小鼠疾病模型，以提升其在藥物研發(fā)研究中的臨床轉化價值與預測性。過去的失敗經驗已經告訴我們，如果選用了不適合或不準確的小鼠疾病模型，或小鼠體內實驗設計不合理等，由此獲得的臨床前實驗結果預測價值，則會大大降低。

讓我們以ALS小鼠疾病模型研究相關實際案例，進行進一步深入的解析。回顧分析ALS小鼠疾病構建歷程，即從起初的SOD1突變轉基因小鼠，到后來新的TDP43突變小鼠疾病模型的發(fā)展過程。現(xiàn)在已經清楚，SOD1突變小鼠疾病模型并不能完全模擬人ALS疾病的所有特征，特別是缺乏該疾病診斷的典型特征，即SOD1患者大腦皮層運動神經元衰退與損失表型，顯示了小鼠與人在運動皮層神經退行性病變方面的差異。還必須清楚一點的是，實際上，此類SOD1突變體轉基因疾病模型的建立，需要依賴該突變基因較高水平的過表達，才能誘發(fā)ALS疾病發(fā)生。而且，野生型人SOD1基因過表達，也可以誘發(fā)小鼠相應的神經退行性改變。因此，有理由認為，過表達SOD1基因本身，足以誘發(fā)該疾病常見表型。

臨床上有超過50%ALS患者，同時伴有額顳葉癡呆（FTLD），而SOD1突變小鼠則未見此表型。提示人與小鼠SOD1致病過程可能存在不同致病通路。所以，由該SOD1小鼠疾病模型研究獲得的轉化預測價值，也就可想而知了。另外，與其他ALS致病基因比較，SOD1基因本身，并不具備其獨特ALS疾病表型，因此，在不同ALS疾病相關基因下游，有可能存在共享的致病通路。

PrP-TDP-43-A315T人突變小鼠是最早構建的TDP-43轉基因小鼠模型，該轉基因小鼠在3個月后，出現(xiàn)體重下降與行為相關等表型，并在153天左右開始死亡。起初的研究表明，約20%脊髓運動神經元損失，到約50%的皮層脊髓束軸突損失的發(fā)展過程。也有研究分別構建了人突變PrP-TDP-43-A315T和人野生型PrP-TDP-43轉基因小鼠模型，且均有超過4倍表達量增加。這些TDP-43轉基因小鼠都表現(xiàn)有存活時間縮短表型，且存活期長短與突變基因拷貝數(shù)負相關。而所有野生型TDP-43轉基因小鼠，卻未見早期死亡現(xiàn)象。

然而，值得注意的是，在仔細分析該研究后發(fā)現(xiàn)，其實研究中構建的兩個過表達轉基因小鼠模型（突變與野生型），TDP-43基因的表達量是有一定差異的，即野生TDP-43基因表達量較突變TDP-43基因表達略低，所以，以前研究中觀察到TDP-43突變小鼠與野生型小鼠的某些表型差異現(xiàn)象，可能是因為轉基因表達量差異所致。而且，如此的分析推論也得到另一個實驗研究結果的間接證實，該研究分別通過比較突變TDP-43-M334V和野生型TDP-43兩種轉基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)，兩種小鼠（突變與野生型）基因表達量相似（均為～3倍增加），且未見兩種小鼠在疾病發(fā)生嚴重程度方面有差異。提示TDP-43基因表達水平的改變，而不是基因突變特征本身，是誘發(fā)小鼠疾病表型的原因。并且，對TDP-43突變小鼠進一步分析研究也發(fā)現(xiàn)，該轉基因小鼠死亡表型，并非由運動神經元功能損傷，導致運動神經元衰退變化，而是由胃腸道功能破壞所致。

由于轉基因小鼠模型構建技術本身的特點，也使該類小鼠疾病模型研究結果的分析與解釋，變得更為復雜。因為應用這種轉基因小鼠研究中獲得的研究結果，是很難將人TDP-43過表達與小鼠內源性tdp-43功能完全區(qū)分開來。而且，想要在人TDP-43轉基因小鼠中，實現(xiàn)轉基因過表達水平控制在接近ALS患者觀察到表達水平，也是相當困難。實際上，有一些ALS患者不僅含有突變TDP-43蛋白，同時也見有另外ALS致病基因，比如C9ORF72基因突變同時出現(xiàn)的現(xiàn)象，而作為ALS致病基因C9ORF72，也可能引起運動神經元受損的特殊病理學改變。

ALS小鼠疾病模型構建策略與方法的不同，可直接影響到疾病基因拷貝數(shù)及表達量等，從而影響到疾病的表型特征與嚴重程度。比如，已知SOD1G93A轉基因小鼠插入的人突變基因可高達25個拷貝數(shù)，表現(xiàn)有快速進行性運動神經元衰退的嚴重損傷，有研究表明，低拷貝數(shù)（～8-10拷貝數(shù)）的人SOD1G93A轉基因小鼠品系，出現(xiàn)癱瘓癥狀時間約在24～34周鼠齡時候，明顯晚于高拷貝數(shù)（～25拷貝數(shù)）轉基因小鼠。如果突變和野生型SOD1轉基因小鼠表達量相似，同樣也有相似的神經學相關表型結果，說明小鼠疾病表型，包括早期輕度癱瘓跡象的脊髓空泡化，甚至運動神經元衰退損失等，可能不是因為突變基因引起，而更可能是因為基因的過表達所致。關于首個報道的ALS小鼠疾病模型，即SOD1G93A突變轉基因小鼠模型，幾乎都沒有研究基因插入位點信息。幸運的是，到目前為止，還未見關于SOD1G93A轉基因的隨機插入，造成對已知基因破壞的報道。

因此，如何構建理想的突變轉基因小鼠模型，實現(xiàn)轉基因表達水平與小鼠內源性基因表達水平相似，以排除可能因為基因過表達本身引起的非特異性作用，目前的實際操作難度卻相當大。因為轉基因小鼠構建常常用到外源啟動子，確保轉基因在特定組織中高表達。而如此異位表達，又可能引起新的非特異性表型。比如，TDP-43A315T轉基因小鼠是應用朊病毒啟動子（Prp），雖然該啟動子具有神經元強活性，但也廣泛表達在其他組織細胞類型，可引起小鼠意外早期死亡，而死亡原因是由于腸道神經退行性病變，而非運動神經元損傷所致。

與隨機轉基因小鼠模型比較，基因定點插入小鼠模型，則具有病程進展較慢，且表型出現(xiàn)也較輕的特點，這可能與研究蛋白表達水平相對較低有關。但基因定點插入小鼠模型保留了基因正確時空表達水平，避免了一些蛋白因為過表達誘發(fā)的非特異性毒性作用，有助于在小鼠生命周期內，研究基因/蛋白與其作用靶標分子間的相互作機制。也有關于ALS小鼠疾病模型的基因定點插入的相關研究報道，比如，將含全人TDP-43 BAC（包括基因內含子和調控序列）插入小鼠Roas26位點，建立ALS小鼠疾病模型。該小鼠表現(xiàn)為人TDP-43低水平表達，只有輕度年齡依賴相關的運動功能障礙表型。另外，TDP-43Q331K突變定點插入小鼠模型，表現(xiàn)有TDP-43增加毒性功能, 即該基因出現(xiàn)剪切改變和蛋白自我調控功能障礙，導致額顳葉癡呆出現(xiàn)，雖然該小鼠模型并未表現(xiàn)包含體或者運動神經元損失表型。一般而言，這類定點插入的小鼠疾病模型，出現(xiàn)表型較慢也較輕，因而有利于揭示疾病癥狀出現(xiàn)的早期特征，有助于尋找早期生物標志物。當然，表型出現(xiàn)較晚，自然增加了相應研究成本。盡管如此，定點插入小鼠疾病模型，為研究疾病發(fā)生早期階段，提供了充裕的研究窗口期。

相反, 轉基因小鼠疾病模型，則常引起明顯表型和顯著運動神經元損失變化，使其成為疾病晚期過程相關研究的潛在選擇。應用小鼠Prp啟動子構建的TDP-43Q331轉基因小鼠模型，不僅表現(xiàn)有運動神經元損失，也出現(xiàn)肌肉退行性改變和伴有運動損傷的神經肌肉結合損傷，但這些表型的出現(xiàn)，都與該基因過表達密切相關，呈現(xiàn)TDP-43表達的明顯計量-效應依賴毒性作用。

如何定義好的小鼠疾病模型。首先，必須真正了解研究者感興趣且需要的小鼠疾病模型，然后，才是尋找最為合適或更好的小鼠模型開展研究，并建議盡量選擇不同策略及技術構建的小鼠疾病模型，開展疾病特征研究。比如，針對ALS小鼠疾病模型，需要了解研究目的是為了關注早期微小的脊髓運動神經元的變化？還是揭示上下神經元的損傷死亡？或者研究神經膠質細胞所發(fā)揮的作用等？

如何選擇合適且理想的小鼠疾病模型。評價與選擇是受諸多因素的影響。而關鍵考慮要素是小鼠疾病模型的設計策略，即小鼠疾病模型是如何設計與構建的，比如，是應用轉基因隨機過表達策略，還是定點/原位插入策略等。當然，研究者需要仔細分析研究小鼠疾病模型表型特征及其影響因素，期望能與對應人疾病表型特征及影響因素相似，比如，性別、年齡與遺傳背景等，因為這些都是影響疾病表型特征的重要因素。總之，合適的小鼠疾病模型需要至少滿足以下幾點：

1. 能夠準確模擬人相關基因特定功能與疾病特征，這是小鼠疾病模型應用于藥物臨床前評價研究最為重要的基石。

2. 有較高的研究結果出現(xiàn)頻率，使其成為可靠科學研究的有力證據(jù)支持。

3. 可被重復驗證，易被其他研究者使用，促進該研究領域發(fā)展進步。

4. 可被廣泛應用，小鼠模型適合其他不同動物設施飼養(yǎng)與繁育等。

在選擇小鼠疾病模型進行藥物臨床前研究的時候，建議參照如下步驟進行：

1. 確定研究疾病目的；

2. 了解影響疾病發(fā)生的內在與外在因素；

3. 查閱已有的相關小鼠模型綜述文獻；

4. 收集研究疾病的生物學信息資料；

5. 明確研究疾病的獨特資源；

6. 確定小鼠疾病模型的初步選擇；

7. 開展小鼠疾病模型初步研究；

8. 分析小鼠疾病模型研究初步結果與生物學信息資料等相關知識間的差距；

9. 評估小鼠疾病模型初步應用研究的有效性；10. 明確小鼠疾病模型的最終選擇。

上期內容回顧：上篇—小鼠疾病模型構建與藥物臨床前評價研究的思考

下期內容預告：下篇我們將講述影響藥物臨床前研究結果預測有效性的因素，敬請期待~