許多人類疾病的發(fā)生與基因突變直接相關(guān)，研究表明，有超過15000基因突變與腫瘤、代謝、神經(jīng)和心血管等疾病發(fā)生有關(guān)。另外，目前已報道的罕見�。ㄒ卜Q孤兒�。┏�過7,000多種，且有超過80%與基因突變密切相關(guān)。遺傳性罕見病已經(jīng)影響到超過3.5億人群，且多為兒童(～50%)。這類疾病通常嚴(yán)重、臨床診斷與治療多復(fù)雜、且多呈慢性發(fā)展。目前絕大多數(shù)遺傳罕見�。ā�95%）仍無有效治療方法。另外，與傳統(tǒng)藥物研發(fā)投入比較，遺傳性罕見疾病藥物研發(fā)投入相對較少。因此，針對遺傳性疾病治療方法及藥物研發(fā)已成為當(dāng)前科學(xué)家們與生物制藥行業(yè)積極關(guān)注的研究領(lǐng)域。然而，由于這類遺傳性罕見病的患者人數(shù)少，不利于藥物（孤兒藥）研發(fā)的臨床試驗研究開展，也成為此類藥物研發(fā)面臨的特殊挑戰(zhàn)。

小鼠模型在模式生物中所具有的獨特綜合優(yōu)勢，不僅表現(xiàn)在遺傳學(xué)與生理學(xué)上與人具有相似性，也有其成本低、繁殖飼養(yǎng)快速方便、遺傳背景明確、以及相應(yīng)基因編輯技術(shù)成熟等有利因素，使其成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究，包括基因功能及致病過程、建立人相關(guān)疾病模型和藥物臨床前評價研究等最為重要的模式動物。通過小鼠疾病模型的構(gòu)建，有助于我們深入揭示潛在致病基因作用機制，為藥物臨床前評價研究提供工具，成為由藥物研發(fā)基礎(chǔ)研究向臨床疾病治療應(yīng)用有效轉(zhuǎn)化的重要橋梁。

小鼠疾病模型有助于遺傳性疾病致病基因的發(fā)現(xiàn)與驗證

在此，借用周斌教授2020年發(fā)表的成功研究案例，簡要說明小鼠疾病模型應(yīng)用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的思路與策略，該研究從臨床患者中篩選到潛在的致病基因，通過相應(yīng)基因編輯技術(shù)，構(gòu)建能與人相關(guān)疾病病理表型關(guān)聯(lián)的小鼠疾病模型，并將其與人疾病病理癥狀特征與相關(guān)基因聯(lián)系起來，達(dá)到驗證與揭示潛在致病基因在誘發(fā)疾病表型過程的作用機制。

作者首先從家族性高膽固醇血糖臨床患者人群中，篩查到低密度脂蛋白受體（LDLR）未知新突變E207X，且體外細(xì)胞實驗證實，表達(dá)突變LDLR基因與其功能改變具有相關(guān)性。為了進一步在體內(nèi)證實該LDLR基因突變與高膽固醇血癥/動物粥樣硬化的因果關(guān)系，賽業(yè)生物應(yīng)用CRISPR/Cas9基本編輯技術(shù)，為作者專門定制了Ldlr-E208X（對應(yīng)人LDLR-E207X）點突變小鼠模型。研究結(jié)果表明，該Ldlr-E208X點突變小鼠模型在高脂飲食誘導(dǎo)下，表現(xiàn)與臨床患者相似的高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化表型，從而建立了模擬家族性人膽固醇血癥及動脈粥樣硬化患者的小鼠疾病模型，為進一步探索該疾病基因療法的臨床前評價研究提供了可能。

作者在Ldlr-E208X點突變小鼠疾病模型基礎(chǔ)上，驗證基因編輯修正療法治療該疾病的可能性與效果。通過將構(gòu)建的AAV8載體介導(dǎo)CRISPR/Cas9編輯基因治療技術(shù)注射到突變小鼠肝臟，觀察小鼠體內(nèi)正常Ldlr蛋白表達(dá)水平及其相關(guān)表型變化，結(jié)果表明，Ldlr蛋白表達(dá)不僅獲得一定程度恢復(fù)，且其原有的高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化表型，也都獲得一定程度的改善。

小鼠疾病模型研究也是人相關(guān)疾病藥物研發(fā)的起點

早期階段科學(xué)假說與疾病潛在藥物治療效果評價，始于小鼠疾病模型構(gòu)建及其實驗室研究。CRISPR編輯技術(shù)的誕生與發(fā)展，使得構(gòu)建基因編輯小鼠疾病模型模擬人相關(guān)疾病更加簡便有效。小鼠疾病模型在研究遺傳性相關(guān)疾病，比如脊髓性肌萎縮癥（SMA）、遺傳性視網(wǎng)膜疾�。↖RD）、阿尓滋海默癥（AD）致病機制與潛在藥物的臨床前研發(fā)中發(fā)揮了積極的促進作用。

2019年，由諾華研發(fā)的治療脊髓性肌萎縮癥（SMA）嬰兒患者的基因療法（Zolgensma），獲美國FDA批準(zhǔn)上市。該藥成為首款獲批上市的一次性基因治療方案（定價212.5萬美元），也是目前最貴的一個基因替代治療的突破性療法，因而具有里程碑意義。

應(yīng)用SMN基因敲除小鼠，研究SMA早期基因治療效果表明，對SMN敲除小鼠出生后一天，進行scAAV9-SMN基因治療，可明顯改善SMA小鼠神經(jīng)肌肉生理學(xué)、運動功能障礙及存活時間。而對出生后5天和10天后小鼠進行相同注射治療，效果則隨之明顯下降。提示基因治療時間的早晚與其治療效果密切相關(guān)。

眼睛被公認(rèn)為是基因治療的理想靶器官

(1) 眼睛有緊密血視網(wǎng)膜屏障(BRB)，使視網(wǎng)膜成為相對免疫特權(quán)組織。對于外來抗原(比如病毒載體)具有耐受性，不會引起嚴(yán)重免疫炎癥反應(yīng)；

(2) 眼睛局部注射病毒載體，引起病毒廣泛擴散風(fēng)險也很低，降低了可能出現(xiàn)的全身副反應(yīng)發(fā)生；

(3) 眼睛器官組織小，需要病毒載體量也相對少，降低了潛在毒副作用；

(4) 眼睛部位手術(shù)相對容易操作，便于實施玻璃體內(nèi)和視網(wǎng)膜下注射病毒載體，達(dá)到治療靶區(qū)域；

(5) 視網(wǎng)膜細(xì)胞為分化和非分裂細(xì)胞，即使用非整合載體（比如AAV），也不用擔(dān)心轉(zhuǎn)基因的丟失；

(6) 用非侵入方法，可較易檢測基因治療后，視力功能及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)等變化；

(7) 典型遺傳性視網(wǎng)膜疾病為雙側(cè)對稱性變性，易于設(shè)置治療對照。

先天性黑矇（LCA）是基因治療眼科疾病的理想選擇

相對與光感（PR）細(xì)胞而言，RPE65基因表達(dá)位于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）層，因而更加便于AAV載體發(fā)揮其有效作用。另外，RPE65基因缺失導(dǎo)致的嚴(yán)重視力減退過程，發(fā)生于20～30年間，并維持相對保守的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化。這也為基因治療發(fā)揮其恢復(fù)視力功能提供了較好機會。2017年，美國FDA批準(zhǔn)了Spark公司AAV-RPE65基因療法（Luxturna），達(dá)到恢復(fù)與改善先天性黑矇（LCA）患者視力作用。該療法售價高達(dá)75萬美元/一只眼(150萬/患者)。

通過構(gòu)建Rpe65基因敲除小鼠模型，建立先天性黑矇(LCA)小鼠疾病模型的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠視錐光傳導(dǎo)特異性相關(guān)基因表達(dá)顯著降低，引起小鼠早期視錐細(xì)胞損失，使光感細(xì)胞平衡狀態(tài)破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。注射9-或11-順式視黃醛至2周齡Rpe65敲除小鼠，可增加該小鼠注射區(qū)域視錐細(xì)胞數(shù)密度2倍。提示缺乏順式視黃醛可能參與早期視錐細(xì)胞衰退變性過程。

針對遺傳性疾病基因治療的主要策略

1. DNA基因替代/增加療法：導(dǎo)入新基因取代突變基因。但對于顯性突變情況，抑制突變基因活性，則是需要首先考慮的治療策略。

2. CRISPR/Cas9基因編輯療法：兩種治療策略，包括直接在體內(nèi)修改突變基因，或者通過體外修改患者來源的相關(guān)細(xì)胞，再回輸編輯后細(xì)胞至治療部位保護。主要的挑戰(zhàn)：如何增加非分裂細(xì)胞基因組重組修復(fù)效率，因為此類細(xì)胞多缺乏HDR機制。

3. RNA基因治療方法：不需要將基因傳送至細(xì)胞核，大大降低基因整合至宿主基因組風(fēng)險的優(yōu)勢。治療策略包括RNA剪切修飾、轉(zhuǎn)錄后基因剪切和RNA編輯等。主要挑戰(zhàn)：降低mRNA傳送過程可能引起的免疫原性，以及提高其穩(wěn)定性。

重組AAV病毒載體

基因治療的發(fā)展給罕見病的治療帶來了希望。不過真正在人身上的治療開始之前，需要有大量的臨床前科研工作為其奠定基礎(chǔ)。其中就包括了載體的選擇，治療策略的確定等。目前如果是體內(nèi)的基因治療，腺相關(guān)病毒無疑占據(jù)著統(tǒng)治地位。重組AAV病毒載體則是目前基因治療最為常用的病毒載體。

優(yōu)點：通常不會引起明顯的免疫反應(yīng)，也不會融入到宿主基因組，能夠在啟動子的控制下表達(dá)。

缺點：因為不整合到細(xì)胞DNA中，當(dāng)細(xì)胞分裂時，就會丟失。

AAV載體包括兩種類型：單鏈AAV (ssAAV)和自我互補AAV (scAAV)載體。當(dāng)細(xì)胞被ssAAV傳導(dǎo)后，單鏈病毒DNA需要先轉(zhuǎn)化為雙鏈形式，這是限速步驟，成為不利因素。scAAV載體病毒感染細(xì)胞后，立即以自我互補方式，形成雙鏈DNA，加速病毒復(fù)制及基因表達(dá)過程，提升了效率。但scAAV載體包裝容量只是ssAAV載體的一半(～2.4kb) 。到目前為止，已經(jīng)在人和靈長類動物中發(fā)現(xiàn)與鑒定有超過12個（約100個變異體）AAV載體。其中血清型2、5、7、8和9為目前較為常用的AAV病毒載體。

下期內(nèi)容預(yù)告：中篇我們將講述小鼠疾病模型在藥物臨床前評價研究中面臨的挑戰(zhàn)，敬請期待~

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