BRGSF小鼠背景回顧

BRGSF（BALB/c Rag2^tm1Fwa Il2rg^tm1Cgn Sirpα^NOD Flk2^tm1lrl）小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一：Rag2和Il2rg基因的敲除使BRGSF小鼠T、B、NK細(xì)胞缺失；SirpαNOD抑制了小鼠巨噬細(xì)胞對人源細(xì)胞的吞噬作用；Flk2基因的敲除使小鼠髓系細(xì)胞組分（特別是樹突狀細(xì)胞，DC）大幅減少（圖1）。這種免疫系統(tǒng)上的高度缺陷使BRGSF小鼠對各類人源移植物高度兼容，同時也是構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠的優(yōu)秀模型。

 

因此，通過在BRGSF小鼠身上進(jìn)行人外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）移植，我們可以得到以人源T細(xì)胞重建為主的PBMC免疫系統(tǒng)人源化小鼠。這種小鼠可用于需要成熟T細(xì)胞的短期研究，例如HIV/AIDS相關(guān)研究。

圖1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠。

 

免疫系統(tǒng)人源化小鼠

人源化小鼠是指攜帶功能性人類基因、細(xì)胞、組織、器官或免疫系統(tǒng)，甚至是微生物的小鼠，可用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床治療方案的開發(fā)。其中，免疫系統(tǒng)人源化小鼠，也稱為人免疫系統(tǒng)重建小鼠，是指通過將人的造血干細(xì)胞、免疫細(xì)胞或組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使其能重建人類免疫系統(tǒng)的小鼠模型。這類小鼠可以更有效地模擬人體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，為人類腫瘤免疫、自身免疫性疾病，以及人特異性傳染疾�。ɡ�如由人類免疫缺陷病毒HIV引起的獲得性免疫缺陷綜合征AIDS）的轉(zhuǎn)化研究提供優(yōu)秀模型。

 

不同類型免疫系統(tǒng)人源化小鼠的對比

根據(jù)重建方法，免疫系統(tǒng)人源化小鼠可大致被分為以下三類。

1 Hu-PBL小鼠，也稱為Hu-PBMC小鼠

構(gòu)建方法：經(jīng)尾靜脈（i.v.）、腹腔（i.p.）或脾內(nèi)（intrasplenic）注射人外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）到成年免疫缺陷小鼠體內(nèi)。

 

人源免疫系統(tǒng)重建時間：約2周。

 

優(yōu)點：

①操作簡單，成本低；

②T細(xì)胞移植效率高。

 

缺點：

①重建以人源T細(xì)胞為主，B細(xì)胞和髓系細(xì)胞數(shù)量較低（可能是因為缺乏與它們生存相關(guān)的人源細(xì)胞因子）；

②產(chǎn)生致死性GvHD（一般在移植后4~6周），實驗窗口期短；

③供體來源不穩(wěn)定，結(jié)果差異較大（可使用多個供體進(jìn)行實驗，以確保療效是藥物特異性，而不是供體特異性的）。

 

應(yīng)用：需要成熟T細(xì)胞的短期研究、GvHD方面的研究，例如HIV/AIDS等。

 

備注：

①PBMC通常由Ficoll-Hypaque密度梯度離心法獲得，這種方法能去除大部分的中性粒細(xì)胞；

②GvHD: Graft vs. Host Disease，移植物抗宿主病。產(chǎn)生GvHD的小鼠會出現(xiàn)體重明顯下降、弓背、脫毛、腹瀉、脫皮等現(xiàn)象；

③可通過敲除免疫缺陷小鼠的MHC-I/II基因，或降低PBMC中CD4⁺T細(xì)胞的比例（可能會降低小鼠適用性），來延緩GvHD的出現(xiàn)。

 

2 Hu-HSC小鼠，也稱為Hu-CD34小鼠

構(gòu)建方法：將來源于臍帶血、胎肝、骨髓，或動員后外周血的人CD34⁺造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）通過尾靜脈、腹腔或骨髓腔，注射到經(jīng)亞致死劑量輻照（或經(jīng)化學(xué)藥物白消安Busulfan處理）進(jìn)行清髓以后的成年免疫缺陷小鼠體內(nèi)；或者肝內(nèi)（intrahepatic）注射HSC到新生免疫缺陷小鼠體內(nèi)。

 

人源免疫系統(tǒng)重建時間：約12周。

 

優(yōu)點：

①多譜系人免疫細(xì)胞分化，包括淋系的T、B、NK細(xì)胞，小部分重度免疫缺陷小鼠也支持人源髓系細(xì)胞分化；

②無/弱GvHD，實驗窗口期長。

 

缺點：

①缺乏供人源T細(xì)胞發(fā)育成熟的人胸腺，T淋巴細(xì)胞數(shù)量較少；

②需要對小鼠進(jìn)行清髓處理；

③供體差異性。

 

應(yīng)用：免疫腫瘤學(xué)、傳染病學(xué)的長期研究，例如免疫細(xì)胞發(fā)育分化、過繼性T細(xì)胞療法（adoptive T cell transfer）、HIV/AIDS等。

 

備注：

①HSC的來源、注射方式、小鼠的年齡、性別和品系等因素都會影響重建效率；

②通過輻照和Busulfan處理破壞小鼠自身HSC，從而促進(jìn)人HSC的植入效率；

③人造血系統(tǒng)及免疫細(xì)胞是由人HSC在免疫缺陷小鼠體內(nèi)發(fā)育而來，對宿主免疫耐受，通常不會發(fā)生GvHD。

 

3 Hu-BLT小鼠

構(gòu)建方法：免疫缺陷小鼠經(jīng)亞致死劑量輻照以后，將人胎肝和胎胸腺移植到小鼠的腎包膜下，同時尾靜脈注射同一供體的胎肝或骨髓來源的HSC。

 

人源免疫系統(tǒng)重建時間：約16周。

 

優(yōu)點：

①人源免疫系統(tǒng)重建最完善的模型；

②具有HLA（human lymphocyte antigen ，人類淋巴細(xì)胞抗原）限制性人源T細(xì)胞（T細(xì)胞可以在人胸腺上皮內(nèi)發(fā)育成熟）。

 

缺點：

①人體組織取自流產(chǎn)胎兒，來源受限，且面臨極大的倫理爭議；

②操作復(fù)雜，且需要對小鼠進(jìn)行清髓處理；

③產(chǎn)生GvHD（一般在移植后20周后）。

 

應(yīng)用：免疫腫瘤學(xué)、傳染病學(xué)的研究，例如HIV/AIDS、細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine-release syndrome，CRS）、免疫檢查點抑制劑副作用等。

 

備注：

①BLT = Bone marrow，Liver，Thymus。

②人源T細(xì)胞可以在人胸腺上皮內(nèi)經(jīng)歷陽性選擇（positive selection），但這種陽性選擇僅針對人源細(xì)胞，與鼠源MHC有親和力的人源T細(xì)胞并不會被清除，因此，Hu-BLT小鼠中的GvHD發(fā)生率比在Hu-HSC小鼠中的要高。

圖2. 三種免疫系統(tǒng)人源化小鼠的構(gòu)建方式。^[5]

 

Case study：構(gòu)建Hu-PBMC BRGS免疫系統(tǒng)人源化小鼠進(jìn)行抗HIV細(xì)胞免疫療法研究

CD4⁺ T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫中的一種重要免疫細(xì)胞，它能識別抗原呈遞細(xì)胞上MHC II類分子呈遞的抗原肽，并啟動免疫應(yīng)答。同時，CD4⁺ T細(xì)胞也是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的主要宿主細(xì)胞，HIV的攻擊會導(dǎo)致其細(xì)胞數(shù)目和功能的下降。

 

有研究表明 HIV-1 X4病毒株在初始CD4⁺ T細(xì)胞和人SupT1（T淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞）都存在的情況下，會優(yōu)先攻擊SupT1細(xì)胞[6]。為了驗證了這個結(jié)論，意大利科學(xué)家Jonathan Fior首先進(jìn)行了體外實驗[7]。為了模擬HIV血清陽性患者的情況，他將SupT1細(xì)胞與人PBMC共培養(yǎng)，并加入HIV-1 LAI病毒株進(jìn)行感染處理（實驗組），或不進(jìn)行感染處理（對照組）。體外實驗結(jié)果顯示，SupT1細(xì)胞可以顯著延緩HIV對PBMC中初始CD4⁺ T細(xì)胞的殺傷作用，HIV優(yōu)先攻擊SupT1細(xì)胞。此外，HIV病毒在SupT1細(xì)胞中持續(xù)復(fù)制后，細(xì)胞病變效應(yīng)降低，對抗體介導(dǎo)的中和反應(yīng)變得更敏感。

 

為了進(jìn)一步在體內(nèi)驗證這個結(jié)果，Dr. Fior將人PBMC注射到BRGSF小鼠的前身——BRGS（BALB/c Rag2tm1Fwa IL-2Rγctm1Cgn SIRPαNOD）小鼠體內(nèi)，構(gòu)建Hu-PBMC BRGS免疫系統(tǒng)人源化小鼠[8]。BRGS小鼠與其“升級版”BRGSF小鼠一樣，缺乏T、B、NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞對人源細(xì)胞吞噬作用弱，可用于構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠。在用HIV-1 LAI病毒株感染Hu-PBMC BRGS小鼠后，每周向小鼠體內(nèi)輸入4×10⁷經(jīng)30Gy輻照后的SupT1細(xì)胞，持續(xù)四周（輻照能有效避免SupT1細(xì)胞在小鼠體內(nèi)增殖，降低致瘤性）。結(jié)果顯示，在接種SupT1細(xì)胞的第一周，加入了SupT1細(xì)胞（PBMC⁺SupT1⁺HIV）的小鼠外周血的病毒載量比對照組（PBMC⁺HIV）少10倍以上，組間差異顯著（圖3）；而且CD4⁺ T細(xì)胞數(shù)目也更多（圖4）。這些實驗數(shù)據(jù)表明體內(nèi)接種經(jīng)輻照過的SupT1細(xì)胞可能是一個有效的抗HIV-1的細(xì)胞免疫療法。

圖3. Hu-PBMC BRGS小鼠外周血中的HIV-1病毒載量[8]。

病毒載量為每毫升血漿中病毒的拷貝數(shù)，數(shù)值以log形式展現(xiàn)。圖中展示了單個小鼠的數(shù)據(jù)（空心圓）和每組平均數(shù)據(jù)（虛線）。紅色虛線表明實驗檢測閾值，低于閾值的數(shù)值不參與統(tǒng)計分析。*p<0.05（t-test統(tǒng)計分析）。

 

圖4. Hu-PBMC BRGS小鼠外周血T細(xì)胞中CD4⁺CD8^-和CD4⁺CD8⁺ T細(xì)胞的含量[8]。

圖中展示了單個小鼠的數(shù)據(jù)（空心圓）和每組平均數(shù)據(jù)（虛線）。*p<0.05（t-test統(tǒng)計分析）。

 

總結(jié)

人源化小鼠是進(jìn)行臨床前藥物研究的優(yōu)秀工具。其中，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行人PBMC、HSC或胎肝、胎胸腺移植而得到的免疫系統(tǒng)人源化小鼠可進(jìn)一步模擬人體的免疫反應(yīng)，評估免疫療法的有效性和安全性，為轉(zhuǎn)化研究提供了可靠的選擇。目前，這些免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型已在多個研究領(lǐng)域得到了使用，包括HIV/AIDS、愛潑斯坦巴爾病毒（EBV）、CAR-T細(xì)胞免疫療法、NK細(xì)胞免疫療法、免疫檢查點抑制劑等。但與此同時，這些模型也存在著一些亟需優(yōu)化的地方，例如，人源免疫細(xì)胞的植入效率、GvHD的產(chǎn)生、人源髓系細(xì)胞的發(fā)育等。深入了解這些模型的優(yōu)缺點將有助于我們選擇更合適的模型進(jìn)行研究，提高臨床轉(zhuǎn)化率。

 

賽業(yè)生物重度免疫缺陷鼠BRGSF及藥效評價服務(wù)

BRGSF小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一，對各種來源的CDX和PDX高度兼容，可用于實體瘤和血液瘤研究。與N*G小鼠不同，BRGSF小鼠為BALB/c背景，其體內(nèi)擁有完整的補體級聯(lián)反應(yīng)，也可用于研究補體依賴的細(xì)胞毒性（CDC）機制。BRGSF小鼠經(jīng)人CD34+造血干細(xì)胞移植重建可得到BRGSF-HIS小鼠，具有所有主要的人造血干細(xì)胞分化亞群，人源髓系細(xì)胞分化完全，人源細(xì)胞長效存在，實驗窗口期長，且無貧血現(xiàn)象。賽業(yè)生物可以根據(jù)您的需求提供BRGSF小鼠及相關(guān)的藥效評價服務(wù)。

 

此外，賽業(yè)生物還可以提供各種有效的腫瘤模型，如傳統(tǒng)免疫缺陷鼠BALB/c nude（裸鼠）和NOD scid、重度免疫缺陷鼠C-NKG、免疫檢查點人源化小鼠、腫瘤細(xì)胞系移植模型、人源腫瘤組織異種移植模型（CDX）、基因修飾模型及表型分析服務(wù)等。我們可以構(gòu)建各類皮下、原位或者轉(zhuǎn)移瘤模型，并針對相應(yīng)的模型提供高度定制化的體內(nèi)藥效學(xué)服務(wù)，以滿足您的需求。

 

參考文獻(xiàn)：

[1] Skelton J.K., Ortega-Prieto A.M., and Dorner M.A. Hitchhiker's Guide to Humanized Mice: new pathways to studying viral infections. Immunology (2018).

[2] 郭文文, 喬天運, 張彩勤等. 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建及其在腫瘤治療研究中的應(yīng)用. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志. 29(11): 98-104 (2019).

[3] Allen T.M., Brehm M.A., Bridges S., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nat Immunol. 20, 770–774 (2019).

[4] Rochere P.D.L., Guil-Luna S., Decaudin D., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 39(9):748-763 (2018).

[5] Rochere P.D.L., Guil-Luna S., Decaudin D., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 39(9):748-763 (2018).

[6] Das A.T., Land A., Braakman I., et al. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263:55–69 (1999).

[7] Fior J. An initial in vitro investigation into the potential therapeutic use of SupT1 cells to prevent AIDS in HIV-seropositive individuals. PLoS One. 7(5):e37511 (2012).

[8] Fior J. SupT1 Cell Infusion as a Possible Cell-Based Therapy for HIV: Results from a Pilot Study in Hu-PBMC BRGS Mice. Vaccines (Basel). 26;4(2):13 (2016).