小伙伴們，我們代謝組學(xué)樣本收集方法系列推文迎來(lái)了第四篇——微生物、微生物培養(yǎng)基的收集方法。近年來(lái)，微生物及其生長(zhǎng)環(huán)境在代謝組學(xué)中的科學(xué)研究愈加頻繁，活躍在科研人的眼前。相信從前面介紹的內(nèi)容中科研小伙伴們一定對(duì)代謝組學(xué)樣本收集有了一些整體概念，接下來(lái)讓我們一起來(lái)看看微生物、微生物培養(yǎng)基的收集方法，加深下理解，let's go�。�！

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1.微生物收集方法

 

• 細(xì)胞數(shù)量：

需要細(xì)菌的數(shù)量為 1*107 cells（此為一次實(shí)驗(yàn)的用量，最好收集兩次實(shí)驗(yàn)的用量，分兩個(gè)離心管存放）。

 

• 取樣時(shí)間：

細(xì)菌生長(zhǎng)指數(shù)中期（mid-log）

 

• 適用菌屬：

大腸桿菌（E.coli）[1,2]

 

• 取樣步驟：

1. 對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算1*107個(gè)菌體所需要的培養(yǎng)液的體積，記錄為1體積； 

2. 快速收集1體積細(xì)菌培養(yǎng)液，并迅速在4℃條件下離心（1000 g， 10min）使細(xì)菌與培養(yǎng)液分離；

3. 除去上清培養(yǎng)液， 將細(xì)菌快速浸入液氮中進(jìn)行淬滅，30s；

4. 淬滅后在冰上解凍，用1體積PBS 緩沖液（需預(yù)冷）洗去殘留的培養(yǎng)液，然后離心（1000 g，4℃, 10min）盡可能將全部的 PBS 緩沖液去除；

5. 保存在-80℃冰箱中。

 

• 適用菌屬：

酵母菌及非絲狀真菌 [3]

 

• 取樣步驟：

1. 對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算1*107個(gè)菌體所需要的培養(yǎng)液的體積，記錄為1體積；

2. -20℃下預(yù)冷淬滅溶液（甘油鹽溶液，pure glycerol and sodium chloride solution (13.5 g/L) to a final ratio of 3:2 (v/v)），準(zhǔn)備4體積；

3. 迅速轉(zhuǎn)移1體積細(xì)菌培養(yǎng)液至上述4體積淬滅溶液中；

4. 快速搖勻溶液后，放入冰水浴中約5min；

5. 使用冷凍離心機(jī)，-20℃條件下離心（36086 g，20min）；

6. 盡可能將全部上清移除，保存于-80℃冰箱中。

 

• 注意事項(xiàng)：

1. 寄送樣本時(shí)請(qǐng)放入足量的干冰以保持低溫條件（根據(jù)過(guò)往項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)：快遞途中干冰消耗率約為 5KG/天，消耗速度與氣溫，泡沫箱厚度(>5cm)有直接關(guān)系，請(qǐng)酌情添加干冰）； 

2. 微生物代謝速度非�？�，因此所有的步驟需要盡快完成；

3. 不同樣本收集的微生物數(shù)量應(yīng)一致。

 

收集方法參考文獻(xiàn)：

[1] Bertini I, Hu X, Luchinat C. Global metabolomics characterization of bacteria: pre-analytical treatments and profiling [J]. Metabolomics, 2014, 10(2):241-249. 

[2] Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69.

[3] Kathleen F Smart, Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography– mass spectrometry, nature protocols | VOL.5 NO.10 | 2010.
 

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2.微生物培養(yǎng)基收集方法

• 樣品量要求：

200ul/sample, 提供兩份樣本并分2個(gè)離心管存放（條件允許最好500ul/sample）

 

• 樣本收集步驟：

1. 將培養(yǎng)液搖勻，快速?gòu)呐囵B(yǎng)瓶中取出一定量的培養(yǎng)液，4℃條件下離心（1000 g，10min）；

2. 移取上清 500ul 至新的離心管中, 迅速放入液氮中淬滅，30s；

3. 淬滅后放入-80℃冰箱中保存。

 

• 注意事項(xiàng)：

寄送樣本時(shí)請(qǐng)放入足量的干冰以保持低溫條件（根據(jù)過(guò)往項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)：快遞途中干冰消耗率約為 5KG/天，消耗速度與氣溫，泡沫箱厚度(>5cm)有直接關(guān)系，請(qǐng)酌情添加干冰）。

 

收集方法參考文獻(xiàn)：

[1] Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media ，Analytical biotechnology, 2005. 

[2] Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69.

[3] Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: Quenching and Extraction Protocols, Metabolites, 2017.

 

小伙伴們發(fā)現(xiàn)了嗎？代謝組學(xué)樣本收集還是有些小規(guī)律的。為了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，樣本量要足夠；為避免引入誤差和雜質(zhì)，經(jīng)手人要少；由于檢測(cè)的是取樣時(shí)樣本的代謝物，所以樣本一定要淬滅；最后為了避免反復(fù)凍融，強(qiáng)烈建議各位科研達(dá)人將樣本進(jìn)行分裝。
 

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最后按照慣例附上我司協(xié)助客戶以微生物胞內(nèi)、胞外為樣本發(fā)表的部分文章，供各位老師參考查閱

 

1. 福建農(nóng)林大學(xué): Le-Xing You, Dan-Mei Pan, Nian-Jia Chen, et al. Extracellular electron transfer of Enterobacter cloacae SgZ-5T via bimediators for the biorecovery of palladium as nanorods.  Environment International 123(2019)1-9. IF=7.297

 

2. 蘭州大學(xué)：Dongmei Xu, Nian Wang, Marketta Rinne, et al. The bacterial community and metabolome dynamics and their interactions modulate fermentation process of whole crop corn silage prepared with or without inoculants. Microbial Biotechnology 2020. IF=5.328

 

3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所：Miaomiao Li, Jinlong Song, Qingyun Ma, et al. Insight into the characteristics and new mechanism of nicosulfuron biodegradation by a Pseudomonas sp. LAM1902. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 2020, January 22;68(3). IF=3.571