2021年3月25日，百時美施貴寶（Bristol Myers Squibb，BMS）公司宣布其抗LAG-3單抗relatlimab聯(lián)合抗PD-1單抗Opdivo（nivolumab）的組合療法，在評估未經(jīng)治療的轉(zhuǎn)移性或不可切除性黑色素瘤患者的II/III期臨床試驗RELATIVITY-047（CA224-047）中，相比 Opdivo單獨用藥可顯著改善患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS），試驗達到主要終點。這是全球首個抗LAG-3抗體的臨床III期數(shù)據(jù)。

 

該試驗采用了隨機、雙盲設(shè)計：一共714位患者以1:1的比例隨機分配，分別接受160 mg relatlimab和480 mg Opdivo組合藥物，或480 mg Opdivo單獨用藥。每四周一次靜脈注射給藥。這次試驗的次要終點——總生存期(overall survival，OS）和客觀應(yīng)答率（objective response rate，ORR）還未達到，試驗還在進行中。在安全性方面，目前固定劑量的聯(lián)合療法耐受性良好，兩個給藥組中都未出現(xiàn)新的安全信號。

 

1 LAG-3簡介

淋巴細胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3，LAG-3），又稱為CD233，由 Triebel及其同事于1990年發(fā)現(xiàn)。LAG-3是一個Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白（Ig）超家族，主要表達在活化T細胞和NK細胞表面。

 

LAG-3是T細胞的一個抑制性免疫檢查點。與PD-1和CTLA-4一樣，LAG-3能負向調(diào)控T細胞的增殖、激活和穩(wěn)態(tài)。在人CD4+細胞中封閉LAG-3能促進細胞增殖，并提高 IL-2、IL-4、IFN-γ和TNFα的表達水平。此外，有研究認為LAG-3參與了調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的抑制性作用[1]。當(dāng)處于腫瘤環(huán)境或慢性感染時，長期的抗原刺激會導(dǎo)致LAG-3持續(xù)高表達，引起T細胞耗竭（exhaustion）。因此，阻斷LAG-3信號通路能促進耗竭T細胞恢復(fù)功能。

 

此外，與CTLA-4和CD28不一樣，研究表明LAG-3可能不是通過與CD4競爭配體MHC II來調(diào)控T細胞活性，而是通過其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域直接向T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號[4]。

 

2 LAG-3結(jié)構(gòu)

人體中，LAG3基因在第12號染色體上（12p13），與CD4（12p13.31）相近。此外，雖然LAG-3和CD4在蛋白質(zhì)水平上只有約20%的同源性，它們在蛋白結(jié)構(gòu)上同源性很高。與CD4一樣，LAG-3的胞外區(qū)也含有4個Ig樣結(jié)構(gòu)域（D1-D4），且都在D1和D2之間、D3和D4之間顯示出了剛性（rigidity），而在D1-D2和D3-D4之間顯示出了相對的靈活性（flexibility）。

 

LAG-3的胞質(zhì)尾由三個部分組成：一個絲氨酸磷酸化位點、一個“KIEELE”模體（motif），和一個谷氨酸脯-氨酸二肽重復(fù)序列（EP repeat）。其中，“KIEELE”模體高度保守，并可能參與了LAG-3下游抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因為缺乏該結(jié)構(gòu)的LAG-3蛋白不能發(fā)揮對T細胞的抑制作用[2]。

 

此外，LAG-3還存在可溶性形式（sLAG-3）。sLAG-3可由可變剪接產(chǎn)生，也可由膜結(jié)合LAG-3經(jīng)蛋白質(zhì)水解切割產(chǎn)生。與膜結(jié)合LAG-3一樣，sLAG-3可以與MHC II結(jié)合，但有研究顯示其只會與一小部分抗原呈遞細胞（APC）上的脂筏微結(jié)構(gòu)域（lipid raft microdomain）上的MHC II結(jié)合[3]。目前關(guān)于sLAG-3的具體作用功能還不明確，有研究表明其與樹突狀細胞（DC）上的MHC II結(jié)合能促進DC的成熟和活化。

圖1. LAG-3和sLAG-3的結(jié)構(gòu)示意圖[4]

 

3 LAG-3的配體

與CD4一樣，LAG-3能與主要組織相容性復(fù)合體II類分子（major histocompatibility complex II，MHC II）結(jié)合。但相較CD4，LAG-3與MHC II的親和力更高（約100倍），因為LAG-3可以通過其D1域中一個由30個氨基酸組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，增強與MHC II的互相作用[4、5]。研究表明，LAG-3能選擇性地與穩(wěn)定的抗原肽-MHC II分子復(fù)合物（pMHC II）結(jié)合，因此，LAG-3能優(yōu)先抑制穩(wěn)定的pMHCII的CD4+T細胞的活化[8]。此外，MHC II主要表達在APC上，但包括黑色素瘤在內(nèi)的多種腫瘤細胞也會高表達MHC II，并且這種異常表達與不良預(yù)后相關(guān)。

 

另外，有研究表明FGL1（fibrinogen-like protein1）也是LAG-3的主要配體之一[6]。FGL1屬于纖維蛋白原蛋白質(zhì)家族，由肝細胞產(chǎn)生分泌，在多種腫瘤細胞上均有高表達，例如前列腺癌和黑素瘤。

 

LAG-3還有兩個可能的配體LSECtin和Galectin-3，它們可以與LAG-3上的聚糖相互作用。LSECtin屬于C-型凝集素，主要在肝臟表達，此外，多種腫瘤細胞會高表達LSECtin，包括黑色素瘤、膀胱癌和胰腺癌。Galectin-3是半乳糖苷粘連蛋白，在多種細胞及惡性腫瘤細胞中均有表達，包括腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細胞和CD8+ T細胞。

圖2. LAG-3的結(jié)構(gòu)及配體[7]

 

4 總結(jié)與展望

LAG-3是一個非常有應(yīng)用前景的免疫治療靶點。正如Jonathan Cheng，BMS的高級副總裁所說，“免疫檢查點抑制劑的單用或組合用藥已經(jīng)改變（腫瘤）治療方法，但仍然有相當(dāng)多的患者可以從利用互補通路來提高抗腫瘤活性的新型聯(lián)合療法中受益�！北M管目前已有多款靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抗體藥物，我們?nèi)匀辉趯ふ腋�多的免疫檢查點，研究它們的作用機制，以期開發(fā)新型的更有效的免疫療法。此外，對免疫檢查點藥物藥效機理的研究也至關(guān)重要，這有助于提高藥物響應(yīng)率、降低耐藥性、改善患者預(yù)后。

 

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賽業(yè)生物CTLA-4/LAG3 雙免疫檢查點人源化小鼠

品系背景：C57BL/6N

 

品系構(gòu)建策略：

CTLA-4/LAG3雙免疫檢查點人源化小鼠模型（hCTLA-4/hLAG3）由hCTLA-4小鼠和hLAG3小鼠雜交得到。hCTLA-4和hLAG3的表達均受內(nèi)源性小鼠啟動子調(diào)控。

 

品系說明：

☑ hCTLA-4和hLAG3在小鼠體內(nèi)具有正常的生理表達和調(diào)節(jié)模式。

☑ CTLA-4和LAG3胞外域人源化，利于CTLA-4和hLAG3靶向藥物的識別。

☑ 保留小鼠CTLA-4和LAG3胞內(nèi)域，保證正常的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

☑ 小鼠靶基因不表達，避免交叉反應(yīng)。

☑ 小鼠的免疫系統(tǒng)功能健全。

 

研究應(yīng)用：

本模型可用于評估hCTLA-4和/或hLAG3靶向藥物在免疫健全小鼠體內(nèi)的有效性及安全性。

 

模型驗證：

1. CTLA-4表達檢測

圖1. hCTLA-4在hCTLA-4/hLAG3 小鼠中的表達模式與mCTLA-4在野生型小鼠中的表達模式一致。

從hCTLA-4/hLAG3小鼠中分離脾細胞，用αCD3/αCD28抗體和mIL-2激活2天（A，B）或指定時間（C，D），檢測hCTLA-4和mCTLA-4的表達情況：（A）Tregs（viable, CD3+CD4+ CD25+Foxp3+）；（B）傳統(tǒng)CD4+ T細胞（viable, CD3+ CD4+ Foxp3-）；（C，D）CD8+ T細胞（viable, CD3+ CD8+）。

 

2. LAG3表達檢測

圖2. hLAG3 在hCTLA-4/hLAG3 小鼠中的表達模式。

從hCTLA-4/hLAG3小鼠中分離脾細胞，用αCD3/αCD28抗體和mIL-2激活2天（A，B）或指定時間（C，D），檢測hLAG3和mLAG3的表達情況：（A）Tregs（viable, CD3+CD4+ CD25+Foxp3+）；（B）傳統(tǒng)CD4+T細胞（viable, CD3+CD4+Foxp3-）；（C，D）CD8+ T細胞（viable, CD3+ CD8+）。

 

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參考文獻：

[1] Huang C.T., Workman C.J., Flies D., et al. (2004) Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21(4):503-13.

[2] Shan C, Li X, Zhang J. (2020). Progress of immune checkpoint LAG-3 in immunotherapy. Oncol Lett. 20(5):207.

[3] Brignone, C., Grygar, C., Marcu, M., et al. (2007). A soluble form of lymphocyte activation gene-3 (IMP321) induces activation of a large range of human effector cytotoxic cells. J. Immunol. 179, 4202–4211.

[4] Andrews L.P., Marciscano A.E., and Drake C.G., et al. (2017). LAG3 (CD223) as a cancer immunotherapy target. Immunological reviews 276,1: 80-96.

[5] Huard B., Mastrangeli R., Prigent P., et al. (1997). Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 27;94(11):5744-9.

[6] Wang J., Sanmamed M.F., Datar I., et al. (2019). Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3. Cell. 176(1-2):334-347.e12.

[7] Ruffo E., Wu R.C., Bruno T.C.,et al. (2019). Lymphocyte-activation gene 3 (LAG3): The next immune checkpoint receptor. Semin Immunol. 42:101305.

[8] Maruhashi, T., Okazaki, Im., Sugiura, D. et al. (2018) LAG-3 inhibits the activation of CD4+ T cells that recognize stable pMHCII through its conformation-dependent recognition of pMHCII. Nat Immunol . 19, 1415-1426.]